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Annexin V-EGFP-碧云天細胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品包裝
C1067S	Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒	20次
C1067M	Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒	50次

Annexin V-EGFP -碧云天細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現(xiàn)在細胞膜表面的磷酯酰的一種細胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進行檢測。
Annexin是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導。但僅Annexin V被報道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰主要分布在細胞膜內(nèi)側(cè)，即與細胞漿相鄰的一側(cè)。在細胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷酯酰外翻到細胞表面，即細胞膜外側(cè)。磷酯酰暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯酰結(jié)合后可以阻斷磷酯酰的促凝血和促炎癥反應活性。
用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰的外翻這一細胞凋亡的重要特征。
本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-EGFP可以進入到細胞漿內(nèi)，與位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰結(jié)合，從而也使壞死細胞呈現(xiàn)綠色熒光。
綜上所述，用Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色后，正常的活細胞不被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-EGFP染色，碘化丙啶染色呈陰性；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色。
一個包裝的本試劑盒共可以檢測20個樣品。

包裝清單：

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	包裝
C1067S-1	Annexin V-EGFP	100μl
C1067S-2	Annexin V-EGFP結(jié)合液	12ml
C1067S-3	碘化丙啶染色液	220μl
—	說明書	1份

Annexin V-EGFP-碧云天細胞凋亡檢測試劑盒的保存條件：

4℃保存，半年有效。-20℃保存，一年有效。AnnexinV-EGFP和碘化丙啶染色液需要避光保存。為了長期保存，可以把碘化丙啶染色液適當分裝后-20℃保存。

注意事項：
盡管經(jīng)測試Annexin V-EGFP反復凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個月內(nèi)推薦4℃保存，并適當注意避免反復凍融。
如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。
如果細胞收集過程中使用了，需注意設(shè)法去除殘留的。殘留的會消化并降解Annexin V-EGFP，最終導致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
需自備PBS。

Annexin V-EGFP -碧云天細胞凋亡檢測試劑盒 使用說明：
1.對于懸浮細胞：
A.在進行完細胞凋亡刺激后，1000g(約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-EGFP的結(jié)合。
B.取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細胞。
C.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
D.加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
E.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。
F.隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
2.對于貼壁細胞：
A.把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除細胞消化液。需避免的過度消化。
B.加入步驟2A中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注意：加入步驟2A中的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的；殘留的會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-EGFP導致染色失敗。
C.取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細胞。
D.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
E.加入10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
F.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。
G.隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
3.對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優(yōu)點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
A.(選做) 如果條件許可，把細胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導結(jié)束后，用可以對多孔板進行離心的離心機1000g離心5分鐘。
B.吸除細胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。(如果條件許可，在吸除PBS00g離心5分鐘。)
C.加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液。
D.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
E.加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
F.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。
G.隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。