樣品實驗方案

簡要概述

1. 用測試化合物制備細胞（200 µL /樣品）

2. 添加Apopxin 紫色500測定溶液

3. 在室溫下孵育30至60分鐘

4. 使用帶有525/40 nm濾光片（AmCyan通道）的流式細胞儀或帶有紫色濾光片組的熒光顯微鏡分析細胞

實驗步驟

1.用Apopxin Violet 500制備和孵育細胞：

1.1用測試化合物處理細胞一段時間（對于用星形孢菌素處理過的Jurkat細胞，需要4-6小時）以誘導(dǎo)細胞凋亡。

1.2離心細胞以獲得1-5×105細胞/管。

1.3將細胞重懸于200 µL分析緩沖液（組分B）中。

1.4向細胞中加入2 µL Apopxin 紫色500（組分A）。

1.5可選：向壞死細胞中加入2µL 100X碘化丙啶（組分C）。

1.6避光保存，于室溫下孵育30至60分鐘。

1.7在使用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，添加300 µL分析緩沖液（組分B）以增加體積。

1.8使用帶有525/40 nm濾光片的流式細胞儀（AmCyan通道）或帶有紫色濾光片組的熒光顯微鏡檢測熒光強度。

2.通過使用流式細胞儀進行分析：

2.1使用帶有525/40 nm濾光片（AmCyan通道）的流式細胞儀定量Apopxin Violet 500。 將碘化丙啶加入細胞后，使用610/20 nm濾光片（PE-Texas red通道）檢測細胞活力。 注意：由于對細胞的分離或收獲過程中可能會發(fā)生特定的膜損傷，因此不對貼壁細胞的Apopxin 結(jié)合流式細胞術(shù)進行常規(guī)測試。

3.通過使用熒光顯微鏡進行分析：

3.1孵育后用移液管吸移細胞懸液，用測定緩沖液沖洗1-2次，然后用測定緩沖液重懸細胞。

3.2將細胞添加到載玻片上。 注意：對于貼壁細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與Apopxin Violet 500孵育后，用Assay Buffer沖洗1-2次，然后將Assay Buffer加到蓋玻片上。 將玻片上的蓋玻片倒置并可視化細胞。 與Apopxin Violet 500孵育后，還可以將細胞固定在2％甲醛中，并在顯微鏡下觀察。

3.3在帶有紫色濾光片的熒光顯微鏡下，用Apopxin 紫色500分析凋亡細胞。當?shù)饣ぬ砑拥郊毎袝r，使用TRITC濾波片檢測細胞活力。 質(zhì)膜上的藍色染料表明Apopxin Violet 500與細胞表面的PS結(jié)合。