我們的Amplite™熒光Caspase 3/7檢測試劑盒使用Ac-DEVD-AMC作為Caspase 3/7活性的熒光指示劑。AMC肽幾乎不發(fā)熒光。 Caspase 3/7對AMC肽的切割產生強熒光AMC，其在440-460nm下熒光監(jiān)測，激發(fā)340-350nm。 它可用于使用熒光酶標儀或熒光計連續(xù)測量細胞提取物和純化酶制劑中Caspase 3/7的活性。百螢生物是AAT Bioquest 的中國代理商，為您提供優(yōu)質的Caspase 檢測試劑/試劑盒。

產品適用儀器

熒光酶標儀

Ex：350nm    Em:450nm   Cutoff:420nm

推薦孔板：純黑色孔板

實驗方案

96孔板測定示例

概述

用測試化合物制備細胞（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）

加入等體積的Caspase 3/7測定溶液

在室溫下孵育1小時

監(jiān)測Ex的熒光強度 / Em = 350 / 450nm

操作方法

1.準備細胞：

1.1對于貼壁細胞：在生長培養(yǎng)基中將細胞在20,000至80,000個細胞/孔/ 90L過夜，96孔板或5,000至20,000個細胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2對于非粘附細胞：從培養(yǎng)基中離心細胞，然后將細胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基濃度為80,000至200,000細胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D賴氨酸平板或20,000至50,000細胞/孔/ 20L用于384孔聚-D賴氨酸板。在實驗之前，在制動器關閉的情況下以800rpm離心板2分鐘。

注意：應對每個細胞系進行單獨評估，以確定誘導細胞凋亡的佳細胞密度。

2.準備庫存解決方案：

2.1在使用前，在室溫下使用組分A，B，C（如果需要，組分D）。

2.2如果需要，制備1mM Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲備液：將100μLDMSO（未提供）直接加入到Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO小瓶中（組分D） ）。該抑制劑可用于確認熒光信號強度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關性。

注意：應將未使用的抑制劑儲備液等分并在-20°C下干燥儲存。

3.準備Caspase 3/7檢測溶液：

將50μL200XCaspase 3/7底物儲備溶液（組分A）和100μL1MDTT溶液（組分C）加入10mL測定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X Caspase 3/7底物儲備液足以進行100次分析，每次分析的反應體積為100μL。未使用的200X Caspase 3/7底物儲備溶液應等分并在-20°C下干燥儲存。遠離光明。

4.運行Caspase 3/7測定：

4.1通過在PBS或所需緩沖液中加入10μL10X測試化合物（96孔板）或5μL5X測試化合物（384-板）來處理細胞。對于空白孔（沒有細胞的培養(yǎng)基），加入相應量的化合物緩沖液。

4.2將細胞板在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需的一段時間（用喜shu堿處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Caspase 3/7測定溶液（來自步驟3）。

4.4在室溫下孵育板至少1小時，避光。

注1：如果需要，在室溫下加入測定溶液10分鐘前，將1L Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1mM儲備液（來自步驟2.2）加入所選樣品，以確認caspase 3 / 7個類似的活動。

4.5在制動器關閉的情況下，以800rpm離心細胞板（特別是對于非貼壁細胞）2分鐘。

4.6在Ex / Em = 350 / 450nm處觀察熒光增加。

圖1。TA 嵌合體對脂質體 Dox 介導的半胱天冬酶3/7活化的影響。將 HeLa M (A)和 BeWo (B)細胞與含有或不含摻入 TA 蛋白的 Dox 載脂質體一起溫育。培養(yǎng)48小時后測定半胱天冬酶3和7的活性。顯示的值表示為使用未處理的單元格獲得的值的百分比。誤差棒對應于標準差(n = 3) ，獲得的值相對于無蛋白質 Dox 負載的脂質體的顯著性是通過單因素方差分析測試(* 表示 p < 0.05)確定的。來源: 牛蛙卵中的唾液酸結合凝集素在體外和體內抑制人類間皮瘤細胞的生長，Takeo Tatsuta 等人，公共科學圖書館，2018年1月。

圖2。ONA 對小鼠腫瘤進展的影響。作為小鼠卵巢癌模型，C57B6小鼠在右側卵巢中注射 iMOC 細胞并施用 ONA (20mg/kg) ，如示意圖(A)所示。大多數(shù)未經處理的 C57B6小鼠在第40天死于癌癥轉移。評估存活時間(B)和腫瘤重量(C，比例尺: 1厘米)。使用免疫染色評估 STAT3活化(D，比例尺: 20μm) ，半胱天冬酶 -3活化(E，比例尺: 200μm)和巨噬細胞(F)在腫瘤組織中的浸潤。報道了 Iba-1陽性巨噬細胞中 F4/80陽性細胞和 CD163陽性細胞的百分比(F)。然后，將裸鼠在腹腔內注射 ES2細胞并給予 ONA (20mg/kg) ，如示意圖(G)所示，然后測定存活率(G)。大多數(shù)未經治療的裸鼠在第20天死于癌癥轉移。來源: 洋蔥素 A 通過抑制癌細胞增殖和巨噬細胞的腫瘤功能來抑制卵巢癌的進展。

圖3。ONA 聯(lián)合抗癌藥物對 EOC 細胞的聯(lián)合作用。將 EOC 細胞(SKOV3，es2和 RMG1)與單個抗癌藥物(PTX，CBDCA 或 CDDP)和 ONA 的無效濃度的組合溫育24小時，然后使用 WST-8測定法(a)測定細胞增殖，并確定每種抗癌藥物對每個細胞系的無效濃度。此外，EOC 細胞與抗癌藥物和 ONA 一起溫育4小時，然后進行半胱天冬酶 -3測定(B)。數(shù)據(jù)以平均值 ± SD 表示。* 與對照相比，p 值 < 0.05，* * p 值 < 0.01(不含抗癌藥物)。此外，將每種 EOC 細胞系(SKOV3: C，ES2: D 和 RMG1: E)與含有或不含 ONA 的每種抗癌藥物(PTX，CBDCA 和 CDDP)的無效濃度一起溫育3小時，然后通過 Western 印跡分析測量 pSTAT3，STAT3和 β-肌動蛋白，如材料和方法中所述。來源: 洋蔥素 A 通過抑制癌細胞增殖和巨噬細胞的腫瘤功能來抑制卵巢癌的進展。