酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（簡稱ELISA）概述

ELISA是一種基于平板的免疫測定法，用于檢測和定量生物分子如抗體、蛋白質(zhì)、激素或肽，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用的角色塑造。在ELISA中，感興趣的靶標(biāo)(通常是抗原)被固定在固體表面上，然后用與酶(如辣根過氧化物酶蛋白(HRP)或堿性磷酸酶蛋白(AP))結(jié)合的抗體進(jìn)行探測。定量是通過與底物孵育實(shí)現(xiàn)的，底物是由酶催化的，產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫吸附法一般分為三類:直接ELISA、間接ELISA和三明治ELISA。

一.直接ELISA

在直接ELISA中,抗原通過被動吸附直接固定在平板表面,并用HRP標(biāo)記的原抗體檢測。將無色底物引入樣品,樣品與酶結(jié)合物反應(yīng),產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)襯底的選擇,這種副產(chǎn)品可以是比色的,化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號產(chǎn)生的數(shù)量與樣品中抗原的數(shù)量成正比。在所有的酶聯(lián)免疫吸附測定格式中,直接酶聯(lián)免疫吸附測定是簡單和最快的,然而,它們是最不敏感的。

比色直接ELISA

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 用檢測抗原、密封板和在4攝氏度下一夜培養(yǎng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板

2. 用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次

3. 在4攝氏度時,用所需封塊溶液進(jìn)行1小時的封塊板

4. 用緩沖器洗盤子3次

5. 在室溫下用HRP標(biāo)記的原抗體注射1小時

6. 用緩沖器洗盤子4次

7. 帶重復(fù)使用的長襯底溶液的嵌入板(CAT編號)?11012 在室溫下持續(xù)15-30分鐘。

8. 用酶聯(lián)免疫吸附儀微平板探測器測量650納米的吸收信號

二.間接ELISA

間接ELISA實(shí)質(zhì)上是直接ELISA的修正版。在間接酶聯(lián)免疫吸附法中,用于檢測抗原的主要抗體是不結(jié)合的。取而代之的是一種酶標(biāo)記的次級抗體,它對主抗體的寄種具有反應(yīng)性,用于檢測主抗原復(fù)合物(間接檢測抗原)。將無色底物引入樣品中,樣品與酶結(jié)合物反應(yīng),產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇,這種副產(chǎn)物可以是比色的,化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號產(chǎn)生的數(shù)量與樣品中抗原的數(shù)量成正比。二次檢測試劑的使用優(yōu)于直接酶聯(lián)免疫吸附測定(即信號放大)。

比色法間接ELISA

試驗(yàn)方法：

1.用檢測抗原、密封板和在4攝氏度下一夜培養(yǎng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板

2.用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次

3.在4攝氏度時,用所需封塊溶液進(jìn)行1小時的封塊板

4.用緩沖器洗盤子2次

5.常溫下未結(jié)合初級抗體植入1小時

6.用緩沖器洗盤子4次

7.用HRP標(biāo)記的二次抗體在室溫下植入1小時(阻斷緩沖)

8.用緩沖器洗盤子4次

9.帶重復(fù)使用的長襯底溶液的嵌入板(CAT編號)?11012 在室溫下持續(xù)15-30分鐘。

10.用酶聯(lián)免疫吸附儀微平板探測器測量650納米的吸收信號

三．三明治ELISA

它要求使用匹配的抗體,每個抗體是針對不同的無重疊抗原表位。其中一種抗體,稱為捕捉抗體,首先被涂在一個多井微滴板的表面,以促進(jìn)固定目標(biāo)抗原。然后第二種抗體,稱為檢測抗體,結(jié)合到捕捉抗體-抗原復(fù)合物(因此術(shù)語"三明治",因?yàn)榭乖墙Y(jié)合在匹配的抗體對之間)。最后,添加了檢測抗體(而不是捕捉抗體)的酶標(biāo)記次級抗體結(jié)合物。一旦二次結(jié)合到檢測抗體,酶標(biāo)記次級抗體催化反應(yīng)與其各自的底物產(chǎn)生可測量的信號。

比色三明治ELISA

試驗(yàn)方法：

1. 含有捕捉抗體、密封板和4攝氏度夜間孵化的pcv微滴板覆蓋井

2. 用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次

3. 在4攝氏度時,用所需封塊溶液進(jìn)行1小時的封塊板

4. 用所需的緩沖器洗盤子2次

5. 在每一口井中添加樣品,在37℃條件下孵化2小時

6. 用所需的緩沖劑將樣品和清洗板拆下2次

7. 常溫下注射1小時非結(jié)合檢測抗體

8. 用所需的緩沖器洗盤子4次

9. 用HRP標(biāo)記的二次抗體在室溫下植入1小時(阻斷緩沖)

10. 用所需的緩沖器洗盤子4次

11. 帶重復(fù)使用的長襯底溶液的嵌入板(CAT編號)?11012 在室溫下持續(xù)15-30分鐘。

12. 用酶聯(lián)免疫吸附儀微平板探測器測量650納米的吸收信號