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當前位置：西安百螢生物科技有限公司>>技術文章>>百螢-Cy3 酪胺產品實驗方案詳情
Cy7酪胺是美國AAT Bioquest生產的Cy系列產品，對于許多免疫組織化學（IHC）應用，傳統(tǒng)的酶促擴增程序足以實現足夠的抗原檢測。但是，有幾個因素限制了這些程序的敏感性和實用性。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質的Cy7酪胺。
適用儀器
熒光顯微鏡 | |
Ex: | Cy3/TRITC濾波片 |
Em： | Cy3/TRITC濾波片 |
推薦孔板: | 黑色透明底板 |
濾波片: | Cy3/TRITC濾波片 |
實驗方案
樣品染色示例
概述
1.固定/透化/阻斷細胞或組織
2.在封閉緩沖液中加入一抗
3.加入HRP偶聯(lián)的二抗
4.準備酪胺工作溶液，在室溫下在細胞或組織中施用5-10分鐘
操作步驟
在沒有額外說明的情況下，所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C，避免反復凍融循環(huán)。該方案適用于細胞和組織染色。
1.制備儲存溶液
Tyramide原液（1000X）加入適量的DMSO，制成1-5mM的酪胺儲備液。
注意：未使用的Tyramide原液可以在2-8℃下儲存
2.制備工作溶液
Tyramide工作溶液（1X）：
將1μLTyramide原液加入1 mL含有0.003％H2O2的緩沖液中。
注意：Tris Buffer，pH = 7.4時可用于獲得佳性能。
注意：Tyramide工作溶液應立即使用。
3. 細胞固定和透化
4. 3.1在室溫下用PBS中的3.7％甲醛或多聚甲醛固定細胞或組織20分鐘。
3.2用PBS沖洗細胞或組織兩次。
3.3在室溫下用0.1％Triton X-100溶液使細胞透化1-5分鐘。
3.4用PBS沖洗細胞或組織兩次。
注意：組織固定，脫蠟和再水化，根據標準IHC方案對組織進行脫蠟和脫水。根據需要使用優(yōu)選的特定溶液/方案進行抗原修復。
4.過氧化物酶標記
4.1任選：通過在過氧化物酶猝滅溶液（例如3％過氧化氫）中孵育細胞或組織樣品10分鐘來淬滅內源性過氧化物酶活性，在室溫下用PBS沖洗兩次。
4.2可選：如果使用HRP偶聯(lián)的鏈霉抗生物S蛋白，建議通過生物S阻斷緩沖液阻斷內源性生物S。
4.3用優(yōu)選的封閉溶液（例如含有1％BSA的PBS）在4℃下封閉30分鐘。
4.4取出封閉溶液，加入在推薦抗體稀釋液中稀釋的一抗在室溫下60分鐘或在4°C下過夜。
4.5用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
4.6向每個樣品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室溫下孵育60分鐘。
注意孵育時間和濃度可根據信號強度而變化。
4.7用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
5.酪胺標記
5.1為每個樣品準備并應用100μL酪胺工作溶液，并在室溫下孵育5-10分鐘。
注意：如果您觀察到非特異性信號，可以縮短酪胺的孵育時間。您應該在不同的孵育時間點使用陽性和陰性對照樣品優(yōu)化孵育期。或者您可以在工作溶液中使用較低濃度的酪胺。
5.2用PBS沖洗三次。
6.熒光成像
1.根據需要對細胞或組織樣本進行計數。AAT提供了一系列細胞核復染試劑，如表1所列。按照試劑提供的說明進行操作。
2.使用具有抗褪色特性的安裝介質安裝蓋玻片。
3.使用適當的過濾器組可視化來自酪胺標簽的信號。
表1.推薦用于核復染的產品
貨號 | 產品名稱 | Ex/Em(nm) |
17548 | Nuclear Blue DCS1 | 350/461 |
17550 | Nuclear Green DCS1 | 503/526 |
17551 | Nuclear Orange DCS1 | 528/576 |
17552 | Nuclear Red DCS1 | 642/660 |
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