Annexin V-mFluor Violet 450標(biāo)記實驗方案及光譜

時間：2023/6/25閱讀：63

膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細(xì)胞表面上的PS結(jié)合，它也可以通過壞死細(xì)胞膜或死細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)部的PS結(jié)合。因此，我們建議將細(xì)胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用，以區(qū)分死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Annexin V-mFluor Violet 450標(biāo)記探針。

光譜：

450標(biāo)記光譜.png

光譜性質(zhì)

　　吸光度(nm)： 406

　　校正因子(260海里)： 0.338

　　校正因子(280海里)： 0.078

　　消光系數(shù)(cm 1米1)：350001

　　激發(fā)： 406 (nm)

　　發(fā)射(nm)： 445

　　量子產(chǎn)率： 0.811

實驗方案

分析方案

概述

用測試化合物（200μL/樣品）制備細(xì)胞

添加Annexin V結(jié)合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細(xì)胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測試化合物處理細(xì)胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.3離心細(xì)胞，得到1-5×105個細(xì)胞/管。

1.4將細(xì)胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5在細(xì)胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細(xì)胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。

2.使用流式細(xì)胞儀分析：

通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細(xì)胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細(xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白V對貼壁細(xì)胞類型進行流式細(xì)胞術(shù)的方法。和van Engelend等人（見參考文獻(xiàn)1和2）。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細(xì)胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細(xì)胞。將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長細(xì)胞。與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細(xì)胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細(xì)胞

Annexin V-mFluor Violet 450標(biāo)記.jpg

圖1所示。膜聯(lián)蛋白的檢測綁定活動V-mFluor™紫450共軛Jurkat細(xì)胞磷脂酰絲*酸。Jurkat細(xì)胞治療沒有(綠色)或1μM staurosporine(紅色)為4小時37oC,然后貼上膜聯(lián)蛋白V-mFluor™紫450共軛30分鐘。熒光強度測量使用究NovoCyte流式細(xì)胞分析儀在太平洋藍(lán)色通道。

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