Cell Meter TUNEL凋亡檢測試劑盒 紅色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的用于檢測細(xì)胞凋亡的試劑盒，DNA片段化代表晚期細(xì)胞凋亡的特征。該試劑盒可提供所有必需成分，并具有優(yōu)化的測定方案。適用于熒光酶標(biāo)儀，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。

光譜：

光譜性質(zhì)

消光系數(shù)：  27500

Ex:       549 (nm)

Em：      648

適用儀器

流式細(xì)胞儀

Ex:       488 nm

Em：     660/20 nm  

通道:     PE-Cy5 通道

熒光顯微鏡

Ex:        TRITC 濾波片組

Em:       TRITC 濾波片組

推薦孔板:      黑色透明底板

熒光酶標(biāo)儀

Ex:        550 nm

Em：        590 - 650 nm

Cutoff：     570 nm

推薦孔板:    純黑色孔板

實(shí)驗(yàn)方案

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1. 用測試化合物準(zhǔn)備細(xì)胞。

2. 與TUNEL工作溶液在37°C下孵育30分鐘至1小時(shí)。

3. 洗滌細(xì)胞。

4. 用4％甲醛（可選）固定細(xì)胞。

5. 用帶FITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FITC通道的流式細(xì)胞儀。讀取Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）處的熒光強(qiáng)度。

 溶液配制 

工作溶液配制

將0.5μL的100X Tunnelyte Green（組分A）添加到50μL的反應(yīng)緩沖液（組分B）中，使總體積為50.5μL的TUNEL工作溶液。 避光。 注意：應(yīng)單獨(dú)評估每個(gè)細(xì)胞系，以確定細(xì)胞密度。 

實(shí)驗(yàn)步驟

1.根據(jù)您的特定協(xié)議，將細(xì)胞培養(yǎng)至密度以誘導(dǎo)凋亡。 對于在96孔板培養(yǎng)物中生長的貼壁細(xì)胞，我們建議大約30,000至50,000個(gè)細(xì)胞/孔，對于非貼壁細(xì)胞，建議大約1至2 x 106細(xì)胞/ mL。 同時(shí)，在每種標(biāo)記條件下，用誘導(dǎo)群體相同的密度培養(yǎng)非誘導(dǎo)陰性對照細(xì)胞群體。 注意：我們用100 nM-1 µM星形孢菌素處理HeLa細(xì)胞4小時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.染色和固色：

2.1取出細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.2向每個(gè)樣品中添加50µL TUNEL工作溶液。
2.3在37°C下孵育30-60分鐘。
2.4除去TUNEL工作溶液，并用200 µL /孔的PBS洗滌細(xì)胞1-2次。
2.5向每個(gè)樣品中添加100uL反應(yīng)緩沖液（組分B）。
2.6使用Ex / Em = 550/590-650 nm（Cut off= 570 nm）的熒光酶標(biāo)儀，帶TRITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FL3通道的流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。
2.7可選：從步驟5中移出反應(yīng)緩沖液，并向每個(gè)孔中添加100 µL /孔/ 96孔板的4％甲醛固定緩沖液（未提供）。注意：對于非貼壁細(xì)胞，請?zhí)砑铀枇浚ɡ?X106細(xì)胞/ mL）的4％甲醛固定液。
2.8在室溫下將平板孵育20至30分鐘。
2.9去除固定劑。
2.10用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，并用100µL PBS /孔/ 96孔板替換。
2.11使用Ex / Em = 550/590-650nm（Cut off= 570 nm）的熒光酶標(biāo)儀，帶TRITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FL3通道的流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。
2.12可選：用1X Hoechst（組分C）在Ex / Em = 350/460 nm處染色細(xì)胞核，以進(jìn)行圖像分析

圖1.與未處理的對照相比，用 100 nM 或 1 μM 星形孢菌素 (SS) 處理 4 小時(shí)后 HeLa 細(xì)胞中 TUNEL 反應(yīng)的熒光圖像。細(xì)胞與 TUNEL 工作溶液在 37oC 下孵育 1 小時(shí)。使用具有 TRITC 濾光片組的熒光顯微鏡分析紅色熒光信號。熒光標(biāo)記的 DNA 鏈斷裂在 SS 處理的細(xì)胞中顯示出強(qiáng)烈的熒光染色。

圖2. TUNEL 染色定義的 BM 中凋亡的 PCa 細(xì)胞。PCa細(xì)胞被泛細(xì)胞角蛋白識別為綠色，TUNEL信號以紅色顯示。比例尺，20 微米。資料來源：Axl 是 TGF-β2 誘導(dǎo)的骨髓中前列腺癌細(xì)胞休眠所必需的， Yumoto 等人，《科學(xué)報(bào)告》，2016 年 11 月。