黃曲霉毒素B₁酶聯(lián)免疫定量測試盒說明書

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物黃曲霉毒素B₁將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭黃曲霉毒素B₁抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素B₁的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素B₁的含量。

一、測試盒組成

    l、包被抗體的反應(yīng)板          96/48/24孔

    2、A試劑：樣品稀釋液         l瓶

3、B試劑：AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液       l套（0，0.1，0.25，0.5，1，2 ng/mL）

    4、C試劑：酶標(biāo)抗原           2/1/l瓶

    5、D試劑：酶標(biāo)抗原稀釋液     l瓶

    6、E試劑：濃縮洗滌液         l瓶

    7、F試劑：顯色底物液al瓶

    8、G試劑：顯色底物液b        l瓶

    9、H試劑：終止液             l瓶

   10、反應(yīng)板框架                 l塊

附：樣品稀釋液（A試劑）的配制方法：

1） 先配制PBS緩沖液 （pH7.4） ： 3.0g Na₂HPO₄.12H₂O,  0.25g NaH₂PO₄.2H₂O, 8.7g NaCl 定容至1000ml?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要按比例配制。  2） 樣品稀釋液（A試劑）：取100ml甲醇，加入900ml PBS緩沖液 （pH7.4） ，混勻即得樣品稀釋液。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按比例配制。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

    l、樣品處理：詳見“樣品處理方法”。

    2、試劑的配制

    （1）每瓶C試劑（酶標(biāo)抗原）中準(zhǔn)確加入1.5mL D試劑（酶標(biāo)抗原稀釋液），充分溶解，配成實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)抗原溶液，2～8℃保存。

    （2）取適量E試劑（濃縮洗滌液）用蒸餾水稀釋20倍待用。

    例如：取3mL E試劑（濃縮洗滌液），加57mL蒸餾水，混勻后制成實(shí)驗(yàn)用洗滌液，足夠24孔使用。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

    l、試劑平衡：將測試盒于室溫中放置15min以上，平衡至室溫。

    2、小孔編號：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要截取相應(yīng)孔數(shù)放置反應(yīng)板框架上。設(shè)定l號孔為儀器調(diào)零孔，2-7號孔為AFB₁標(biāo)準(zhǔn)對照孔，其余孔為樣品孔。

    3、洗滌：每孔加入250µL左右洗滌液，洗滌液不得溢出，放置1min后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗板一次。

    4、反應(yīng)組成：按下列步驟所示（見表1），依次加入配制好的溶液及待測樣液。

    *步：l號孔加入50µL A試劑（樣品稀釋液），2-7號孔分別加入系列的B試劑（AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL） 50µL，其余孔加入相應(yīng)的待測樣液。

    第二步：l號孔加入50µL D試劑（酶標(biāo)抗原稀釋液），其余各孔均加入50µL C試劑（酶標(biāo)抗原溶液）。

    第三步：輕輕地振搖，使各孔中的反應(yīng)物混勻。

表1    反應(yīng)物組成

    5、反應(yīng)：將反應(yīng)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min。

    6、洗滌：取出反應(yīng)板，用力甩掉反應(yīng)液，拍干。每孔加入250µL左右洗滌液，洗滌液不得溢出，放置2min后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗板4次。

7、顯色：每孔分別加入F試劑（顯色底物液a）和G試劑（顯色底物液b）各50µL，搖勻，將反應(yīng)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色15min。

    8、終止與儀器測定：每孔分別加入H試劑（終止液）50µL，搖勻后用酶標(biāo)測定儀（或黃曲霉毒索B₁測定儀）在450nm波長處測定各孔的吸光度A值。

    9、樣品定量計(jì)算：

將系列AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL）測得的吸光度A值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線（見示意圖）。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)液濃度的常用對數(shù)值（1gC），縱坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)液孔A值與0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液孔的A值的比值（A_{（標(biāo)準(zhǔn)液）}／A_（0ng/mL））。

黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖

（注：示意圖僅供參考）

計(jì)算待測樣品孔A值與A_（0ng/mL）的比值（A_樣品/A_（0ng/mL）），查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到相應(yīng)待測樣液濃度（C）的常用對數(shù)值lgC，對其求反對數(shù)，可求得待測樣液的AFB₁濃度C。按下列公式計(jì)算出樣品中AFB₁的含量：

V

  AFB₁含量（ng/g）=C ×      × D

m

  式中：C：待測樣液中AFB₁含量（ng/mL）

        V：樣品提取液體積（mL）

        m：樣品質(zhì)量（g）

        D：樣品稀釋倍數(shù)（見表2）

四、測試盒貯存

    1、2～8℃貯存，忌0℃以下凍存。

    2、有效期6個月。

五、AFB₁國家允許量標(biāo)準(zhǔn)請參閱表2

六、相關(guān)檢測依據(jù)：[GB/T5009.22-2003，GB/T17480-1998, AOAC-IUPAC方法 （JAOAC72.326（1989）]

七、批號：見測試盒

樣品處理方法

一、食品

l、脂肪含量小的固體樣品（如大米、玉米、小米等）

    稱取5.0g樣品（已粉碎）于100mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入25.0mL甲醇水（1+1）溶液，振搖15min，過濾，棄去l/4初濾液，收集試樣濾液，此液為樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

2、醬油、醋

    稱取5.0g樣品于25mL小燒杯中，用5mL蒸餾水將試樣轉(zhuǎn)移到125mL分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經(jīng)盛有約5g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水Na₂S0₄的快速定性濾紙過濾于100mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，zui后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入25.0mL甲醇水（1+1）溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解得樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

3、食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等）

    稱5.0g油樣于25mL小燒杯中，用20mL石油醚或正已烷分?jǐn)?shù)次將試樣轉(zhuǎn)移到125mL分液漏斗中，準(zhǔn)確加入25.0mL甲醇水（1+1）溶液，加塞振搖5min，靜置分層，放出下層甲醇水提取液，此液為樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

4、葡萄酒

    稱取5.0g葡萄酒于l25mL分液漏斗中，加入20mL三氧甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經(jīng)盛有約5g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水Na₂S0₄的快速定性濾紙過濾于100mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，zui后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入25.0mL甲醇水（1+1）溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解得樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

5、啤酒、黃酒

    準(zhǔn)確吸取5.0mL樣品于25mL容量瓶，準(zhǔn)確加12.5mL甲醇，再用蒸餾水定容至25mL。振搖10min，即為待測樣液。將待測樣液進(jìn)行定量或*。

    若結(jié)果為陽性，則采用葡萄酒中AFB₁的提取方法進(jìn)行驗(yàn)證。

6、花生

    樣品去皮粉碎（刀切或剪切），稱取5.0g于100mL具塞三角瓶中。加入25.0mL甲醇水（1+1）溶液和20mL正已烷（或石油醚），振搖l0min，過濾于分液漏斗中，靜置分層，放出下層甲醇水提取液，此液為樣品提取液，根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

7、月餅、桃酥、花生醬等

    稱取10.0g試樣于125mL具塞錐形瓶中，加入50.0mL甲醇水（l+1）溶液和20mL正已烷（或石油醚），加塞振蕩15min，過濾，收集濾液于分液漏斗中，靜置分層。放出下層甲醇水提取液于另一錐形瓶中。

    準(zhǔn)確吸取10.0mL甲醇水提取液（相當(dāng)于2.0g樣品）于l25mL分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經(jīng)盛有約5g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水Na₂S0₄的快速定性濾紙過濾于100mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，zui后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入10.0mL甲醇水（1+1）溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解得樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

8、面粉

    稱取10.0g面粉樣于100mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入50.0mL甲醇水（1+1）溶液，振蕩15min，過濾，收集濾液。

    準(zhǔn)確吸取10.0mL濾液（相當(dāng)于2.0g樣品）125mL分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經(jīng)盛有約5g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水Na₂S0₄的快速定性濾紙過濾于100mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，zui后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入10.0mL甲醇水（1+1）溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解得樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

二、飼料

l、一般飼料及原料

    稱取5.0g樣品于100mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入25.OmL甲醇水（1+1）溶液，振蕩15min，過濾，棄去1/4初濾液后收集濾液，此液為樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

    將待測樣液進(jìn)行定量或*。

2、飼料濃縮料

    稱取10.0g樣品于100mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入50.0mL甲醇水（1+1）溶液，振蕩15min，過濾，棄去1/4初濾液后收集濾液。

準(zhǔn)確吸取10.0mL濾液（相當(dāng)于2.0g樣品）于125mL分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經(jīng)盛有約5g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水Na₂S0₄的快速定性濾紙過濾于100mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，zui后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入10.0mL甲醇水（l+1）溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解得樣品提取液。根據(jù)樣品的國家允許量標(biāo)準(zhǔn)（見表2），用A試劑（樣品稀釋液）將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，即為待測樣液。

將待測樣液進(jìn)行定量或*。

表2：黃曲霉毒素國家允許量標(biāo)準(zhǔn)暨樣品稀釋表

附注：總稀釋倍數(shù)V/m *D（見第4頁），V---樣品提取液體積（mL），D---樣品稀釋倍數(shù)， m---樣品質(zhì)量（g） 。另色拉油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB13103-91 和精練食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB15197被GB2716－2005覆蓋取代。

實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

■操作流程

樣品提取  適當(dāng)稀釋  試劑準(zhǔn)備  加樣  免疫反應(yīng)  37℃，30min

顯色反應(yīng) 37℃，15min  結(jié)果判定  目測法、儀器法  計(jì)算含量

■注意事項(xiàng)

l、每次實(shí)驗(yàn)時應(yīng)盡量使用新配制的洗滌液；

2、洗滌時要迅速，洗滌液不可溢出，以防交叉污染；

3、每次洗滌要先用力甩干后再拍干，zui后要擦干板底，以利于儀器檢測；

4、試劑使用前要搖勻；

5、加樣時要準(zhǔn)確，直接加到小孔底部，不可有氣泡，不要加到    孔壁上；

6、整個加樣過程要快，保證前后反應(yīng)時間一致；

7、加樣后要輕輕震搖整板，使反應(yīng)液混勻；

8、不同批次測試盒的試劑不能混用；

9、雖AFB₁標(biāo)準(zhǔn)濃度很低，但是嚴(yán)格規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作不可忽視,　凡接觸到標(biāo)樣的器皿都要用5％NaCl浸泡半天后再清洗備用。

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