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PCR-熒光探針法 |羊源、鴨源、豬源、牛源性成分多重核酸檢測試劑盒

時間:2023-4-10閱讀:61
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該試劑盒采用探針法四重實時熒光定量PCR技術(shù),針對羊源、鴨源、豬源、牛源性成分核酸序列設(shè)計特異性引物和熒光探針,通過實時熒光定量PCR(Taqman探針法) 擴增曲線判斷肉及肉制品中羊源、鴨源、豬源、牛源性成分核酸進行定性及定量檢測。

適用儀器:

ABI系列 (ABI 7300/ABI 7500/Step One等),羅氏LightCycler系列,伯樂CFX 96 ,北京鯤鵬基因X系列,三獅生物Q162D等實時熒光定量PCR儀。

實驗操作:

1. 樣本制備 (樣本制備區(qū))

參照總DNA/RNA提取試劑盒說明書,或使用ES08全自動核酸提取儀配套快速核酸提取試劑盒 (磁珠法),或其他符合相關(guān)標準的核酸提取試劑盒/方法,對樣本進行核酸提取。提取的核酸盡量及時進行檢測,否則于-20℃保存。

2.配制反應(yīng)體系 (加樣區(qū))

2.1 取出多重反應(yīng)液管,陽性對照管,陰性對照管,室溫條件下使試劑解凍,離心10秒,將管壁和管蓋內(nèi)的液體離心至管底,放在冰盒中備用。

2.2 取實驗所需的PCR反應(yīng)管 (n+2 ,即n個待檢樣本+陽性對照+陰性對照) ,反應(yīng)液充分吹吸混勻后,分別吸取 24μL反應(yīng)液至每個PCR反應(yīng)管內(nèi),然后依次添加 1μL陰性對照、樣本核酸和陽性對照,蓋好管蓋,作好記錄,每個反應(yīng)總體積為 25μL 。充分混勻,離心 30 秒后在 實時熒光定量PCR儀上進行擴增實驗。

3.熒光PCR擴增 (擴增及產(chǎn)物分析區(qū))

95℃預(yù)變性 5 分鐘;95℃變性 10 秒,58℃退火延伸 30 秒,40 個循環(huán),在 58℃時收集熒 光信號。熒光基團選擇FAM/VIC/ROX/CY5 ,淬滅基團選擇None。

4.結(jié)果判定

4.1 陽性對照FAM/VIC/ROX/CY5 通道的Ct值均<30 且出現(xiàn)“S"型擴增曲線,陰性對照 無Ct值或Ct值≥40 且無“S"型擴增曲線,實驗結(jié)果有效;否則應(yīng)重新進行實驗。

4.2 待檢樣本FAM/VIC/ROX/CY5 通道的Ct值≤36 且出現(xiàn)“S"型擴增曲線,判定為陽性。 FAM通道陽性表明樣本中含有羊源性成分,VIC通道陽性表明樣本中含有鴨源性成分,ROX通道陽性表明樣本中含有豬源性成分,CY5 通道陽性表明樣本中含有牛源性成分。

4.3 樣本檢測結(jié)果 36<Ct<40 ,判定為可疑。應(yīng)對樣本進行復(fù)測,如復(fù)測Ct值<40 ,且有 明顯的擴增曲線,則判定為陽性,否則判定為陰性。

4.4 樣本檢測結(jié)果無Ct值或Ct值≥40 且無“S"型擴增曲線,判定為陰性。


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