目前疫情的防控工作取得了階段性的成效，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)在病毒快速鑒定及確診中發(fā)揮了重要作用。

什么是實(shí)時(shí)熒光定量PCR?

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù)，簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR,是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)(熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行相對(duì)定量、定量和定性分析。

實(shí)驗(yàn)流程：

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，可以分為樣本采集，RNA提取，RNA質(zhì)量鑒定，反轉(zhuǎn)錄及數(shù)據(jù)分析幾個(gè)步驟，在進(jìn)行引物、模板的稀釋?zhuān)噭┑呐渲坪脱a(bǔ)足反應(yīng)體系時(shí)都會(huì)用到水，水質(zhì)量的好壞直接影響最終數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。

水中的顆粒物，離子含量，有機(jī)物及細(xì)菌微生物等雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)都會(huì)帶來(lái)影響，關(guān)注的因素有以下兩個(gè)方面：

1. DNA酶和RNA酶

DNA酶和RNA酶能夠特異性地降解DNA和RNA。在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，去除這兩種酶從而保證提取的RNA和DNA樣本的完整性十分關(guān)鍵。尤其在提取RNA的時(shí)候，RNA極易被降解。這是因?yàn)镽Nase非常穩(wěn)定，且無(wú)處不在，用常規(guī)的高溫高壓蒸汽方法和蛋白酶抑制劑不能使所有的RNase失活。如果樣本中的核酸被降解，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至造成假陰性檢測(cè)結(jié)果。

因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)用超純水必須有效降低DNA酶和RNA酶的含量，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

2. 鎂離子

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)需要根據(jù)不同的引物對(duì)和模板確定的鎂離子濃度。

Mg2+濃度過(guò)低，會(huì)影響DNA聚合酶的活性，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，影響實(shí)時(shí)定量的敏感性;

Mg2+濃度過(guò)高，會(huì)增加引物二聚體的形成，這會(huì)影響特異性。

因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)用超純水必須控制Mg2+濃度，避免背景因素帶來(lái)的不確定性。

綜上，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)推薦使用超純水，水質(zhì)要求如下圖所示：