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實驗檢測助手——質(zhì)粒圖譜如何“瞅”
2021-1-29 閱讀(3654)
每當(dāng)拿到一個質(zhì)粒圖譜，是不是一下就有點懵了？這些ori、RBS、tet是什么？這些箭頭代表什么，轉(zhuǎn)錄的方向嗎？不要著急，劍鈍生物把這些告訴你，也許會解決你的困惑。
質(zhì)粒和載體傻傻分不清楚
質(zhì)粒(Plasmid)是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子(即細(xì)胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型。
載體即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。細(xì)菌或病毒質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。
簡而言之，質(zhì)?？梢哉f是一個統(tǒng)稱，載體是質(zhì)粒改造過用來運載的工具
選用質(zhì)粒做載體的要求
以常用的為例
（1）選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；
（2）一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴增不受約束，一般 10 個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10 個。
（3）必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；
（4）必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr。
無論選用哪種載體，先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。
如何一眼看穿質(zhì)粒圖譜
① 復(fù)制起始位點Ori，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒），Ori的箭頭指復(fù)制方向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向（正向）。
② 再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記：
Ampr：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
tetr ：可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
camr：生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。
neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
hygr：使潮霉素β失活。
③ 看多克隆位點（MCS）：它具有多個限制內(nèi)切酶的單一切點（質(zhì)粒上只能有該內(nèi)切酶的*酶切序列，不然就一刀好幾段了），便于咱們要研究的基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選，常見的是β-半乳糖苷酶的藍(lán)白斑篩選系統(tǒng)。
④再看外源DNA插入片段大?。嘿|(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA的片段。一般來說，外源DNA的片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。
⑤ 是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子（promoter）－核糖體結(jié)合位點（RBS）－轉(zhuǎn)錄終止信號（AATAAA同時是poly A）。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。
⑥看報告基因：主要是為了能迅速檢查功能基因是否表達(dá)的陽性判斷，表達(dá)成功的蛋白在小鼠體內(nèi)分布位置。
⑦看質(zhì)粒圖譜上的箭頭：它代表DNA兩條鏈（正義鏈和反義鏈），即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。
目的基因片段進(jìn)行連接。
