jinpai基質(zhì)膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)膠，這種基質(zhì)是通過基因編輯技術(shù)將多種表達(dá)膠原蛋白的基因序列插入到經(jīng)永生化處理的小鼠細(xì)胞體系中，并在實(shí)體中抽提出來的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白?；啄せ|(zhì)也含有轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮生長因子、類胰島素生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和在中自然出現(xiàn)的其他生長因子。

推薦應(yīng)用

此款基質(zhì)膠是篩選出的確保能進(jìn)行類器官培養(yǎng)的基質(zhì)膠。如果遇到不能用其他類型的基質(zhì)膠培養(yǎng)的類器官，使用該系列基質(zhì)膠可以保證實(shí)驗(yàn)的有效性和重現(xiàn)性。例如，小鼠腸道類器官、肺類器官、類器官等。

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品參數(shù)

來源：小鼠

外觀：①顏色：含酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為黃色-粉紅色，無酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為半透明淡黃色； ②形態(tài)：標(biāo)準(zhǔn)型基質(zhì)膠4℃溶解后，呈透明流動(dòng)液態(tài)狀態(tài)；高濃度基質(zhì)膠0℃溶解后，呈透明流動(dòng)液態(tài)狀態(tài)，4℃久置呈半凝膠狀。

濃度多樣性： 蛋白濃度范圍在8~26mg/mL之間

內(nèi)毒素： ≤ 4.5EU/ mL

凝膠時(shí)間：室溫條件下5-30min凝膠，溫度22°C至37°C時(shí)成膠速度加快

2D/3D應(yīng)用非常廣泛：干細(xì)胞研究(分化、維持）、研究（侵襲）、 3D細(xì)胞培養(yǎng)（類器官、3D細(xì)胞球）、體內(nèi)植入（皮下、血管生成、栓塞）

產(chǎn)品質(zhì)量控制規(guī)范

• 通過小鼠抗體產(chǎn)物（MAP）檢測進(jìn)行常規(guī)小鼠菌落病原體篩選

• 提取自不含LDEV的小鼠細(xì)胞

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進(jìn)行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進(jìn)行嚴(yán)格控制

• 對細(xì)菌、真菌和支原體進(jìn)行檢測，確保陰性

• 使用BCA方法測定蛋白濃度

• 使用血清學(xué)方法檢測內(nèi)毒素水平

• 在37℃下進(jìn)行14天的凝膠穩(wěn)定性測試

• 每批次產(chǎn)品進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證（類器官培養(yǎng)與分化實(shí)驗(yàn)；皮下實(shí)驗(yàn)；干細(xì)胞培養(yǎng)；血管生成實(shí)驗(yàn)等）

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進(jìn)行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進(jìn)行嚴(yán)格控制

使用注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)環(huán)境

• 環(huán)境溫度：20–25℃ ；環(huán)境濕度：40–60%。

• 請穿戴個(gè)人防護(hù)裝置，注意實(shí)驗(yàn)室安全。

溫度控制

• 基質(zhì)膠產(chǎn)品儲(chǔ)存在-20℃時(shí)是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。在-20℃冰箱中儲(chǔ)存分裝物直到準(zhǔn)備使用。請不要儲(chǔ)存在無霜冰箱中。請務(wù)必保持產(chǎn)品的凍存狀態(tài)。

• 因?yàn)槟；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠 在10℃以上會(huì)開始凝膠化。所以需謹(jǐn)記：?；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠 和所有與模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 接觸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基都應(yīng)該預(yù)冷。在實(shí)驗(yàn)的全部過程中請務(wù)必保持?；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠 處于冰上。

避免污染

• 實(shí)驗(yàn)操作人員需嚴(yán)格區(qū)分實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)、清潔區(qū)和污染區(qū)，確保插取吸頭、加樣、丟棄吸頭的動(dòng)作呈單向流動(dòng)。

• 實(shí)驗(yàn)后使用含 0.5% 次氯酸的消毒液對實(shí)驗(yàn)操作區(qū)消毒。

其他

• 請將基質(zhì)膠產(chǎn)品小瓶淹沒在碎冰中，并放置在4℃冰箱里過夜解凍模基生物基質(zhì)膠，蛋白濃度高時(shí)可能需要更多時(shí)間。請將?；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠 全程保持在冰上。無論是開蓋取用產(chǎn)品或者對產(chǎn)品進(jìn)行分裝，請保持無菌操作。

• 操作過程中，需使用預(yù)冷的移液管輕柔地吹打混勻模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 以確保其均勻性。將模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 分裝到離心管中，每當(dāng)?；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠 堵塞吸頭和/或移液管測量不精確時(shí)請更換吸頭。如果將產(chǎn)品放置在4℃的冰上 24-48個(gè)小時(shí)，凝膠化的?；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠 可能會(huì)被重新水化。

操作說明

分裝操作說明

基質(zhì)膠產(chǎn)品儲(chǔ)存在-20℃時(shí)是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。以下為實(shí)驗(yàn)操作者進(jìn)行分裝操作說明。

1.將基質(zhì)膠置于預(yù)冷盒或碎冰中，放入 4℃冰箱，過夜解凍。

2.將無菌離心管、無菌槍頭等接觸基質(zhì)膠的耗材放預(yù)冷盒中或冰箱中預(yù)冷，分裝前將融化好的基質(zhì)膠表面清潔后放入預(yù)冷盒或碎冰上。

3.在潔凈工作臺(tái)中，用1mL移液槍吸取250µL基質(zhì)膠到離心管里(或根據(jù)每次用量多少進(jìn)行分裝)，標(biāo)注好信息，操作過程中盡量保持低溫，縮短操作時(shí)間。

4.分裝完成后放冰盒中，防止傾倒，并于冰箱保存。分裝后放置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｕ埐灰獌?chǔ)存在自動(dòng)除霜的冰箱中儲(chǔ)存。使用前將基質(zhì)膠插入預(yù)冷盒或碎冰中，并放置于4°C冰箱中，在冰上過夜解凍，使基底膜基質(zhì)膠在穩(wěn)定的低溫環(huán)境中緩慢充分融化。

使用方法說明

包被涂層方法  

?；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠可以以幾種方式使用。薄層凝膠法適用于在凝膠頂部接種細(xì)胞，厚層凝膠法允許您在三維基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，薄層包被法(不凝膠化)給您提供了復(fù)雜的蛋白質(zhì)層，您可以在其上培養(yǎng)細(xì)胞。您的選擇基于您想要實(shí)現(xiàn)的最終結(jié)果，無論是細(xì)胞生長、附著還是分化。

一、薄層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上，以 50 µl/cm2 向生長表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在 37 ℃，30 分鐘。

4.如果有必要的話，請?jiān)谑褂脽o血清培養(yǎng)基輕柔漂洗前吸出未結(jié)合的材料。請確保移液器的吸頭不要刮擦包被的表面。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

二、薄層包被法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.使用無血清培養(yǎng)基將模基生物基底膜基質(zhì)稀釋到需要的濃度。對于您的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，您應(yīng)該完成以經(jīng)驗(yàn)為主的研究來確定您的zuishi包被濃度。

3.向被包被的容器中加入稀釋的模基生物 基底膜基質(zhì)。加入的量應(yīng)該足以容易地覆蓋整個(gè)生長表面。在室溫下培養(yǎng) 1 個(gè)小時(shí)。

4.吸出未結(jié)合的材料并使用無血清培養(yǎng)基輕柔地漂洗。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

三、厚層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上。向?；锘啄せ|(zhì)中加入細(xì)胞并使用預(yù)冷的移液管懸浮。以150-200µl/cm2 向生長表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在37℃，30分鐘?，F(xiàn)在可以添加培養(yǎng)基了。細(xì)胞也可以培養(yǎng)在這一凝膠的頂部。

細(xì)胞復(fù)蘇：

使用細(xì)胞復(fù)蘇溶液在冰上 7 小時(shí)內(nèi)解聚?；锘啄せ|(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)將生長在?；锘啄せ|(zhì)上的細(xì)胞zuiyouxiao地復(fù)蘇，或者使用zhongxingdanbaimei，考慮到連續(xù)培養(yǎng)，zhongxingdanbaimei作為一種金屬酶可以分散細(xì)胞。

應(yīng)用操作說明

以下以小鼠小腸類器官原代建立實(shí)驗(yàn)為例來進(jìn)行?；?strong>類器官jinpai基質(zhì)膠的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)操作說明。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1.1熟練掌握小鼠小腸類器官原代建立技術(shù)。

1.2了解掌握小鼠多種組織來源類器官原代建立技術(shù)。

1.3觀察記錄小鼠小腸原代類器官生長、擴(kuò)增過程中類器官形態(tài)的變化。

二、實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)策略采取從成體干細(xì)胞中建立和維持小鼠小腸類器官的方法。小鼠小腸類器官主要由干細(xì)胞、腸祖細(xì)胞和腸絨毛細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機(jī)制研究的理想體外模型。

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑

1、儀器：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫水平式離心機(jī)、倒置顯微鏡、低溫冰箱、搖床

2、材料：細(xì)胞培養(yǎng)板（規(guī)格為 24 孔、48 孔和 96 孔）、離心管（規(guī)格為 1.5 mL、15 mL 和 50 mL）、細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑規(guī)格為 2.5 cm、6 cm和10 cm）、移液器（規(guī)格為 2.5 μL、10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL 和 5000 μL）、無菌吸頭（規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、無菌鑷子、無菌組織剪、70μm細(xì)胞過濾器、手術(shù)刀片

3、實(shí)驗(yàn)試劑：小鼠小腸類器官培養(yǎng)試劑盒、EDTA (0.5M, pH 8.0) 、潤洗液、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、基質(zhì)膠、DPBS

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

4.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

? 小鼠小腸類器官培養(yǎng)試劑盒、基質(zhì)膠4℃化凍

? 小鼠小腸類器官wanquan培養(yǎng)基的制備：將200μL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至 9.76mL Mouse Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 小鼠小腸類器官wanquan培養(yǎng)基。 室溫平衡，可在 2-8°C 儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。

? 準(zhǔn)備足量添加1%雙抗的DPBS

? 準(zhǔn)備足量添加0.1%BSA的DPBS

? 配制5mM EDTA溶液：4mL預(yù)冷DPBS溶液加40μL 0.5M EDTA溶液pH8.0，置冰上備用。

4.2 取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出近胃端3~10cm腸組織，用鑷子去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含雙抗的DPBS溶液中。

4.3 清洗：使用shoushujian將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗2次。 將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用DPBS清洗2遍。

4.4 消化：將清洗好的腸段轉(zhuǎn)移至含有5mmol/L EDTA 的預(yù)冷 DPBS 中消化，置于4℃孵育20~30min，消化20分鐘可用移液器輕柔吹打腸段，取上清顯微鏡下觀察，待上清出現(xiàn)完整隱窩即可終止消化，若無隱窩可適當(dāng)延長消化時(shí)間。

4.5 清洗：消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)2次以去除 EDTA。

4.6 重懸：用 5mL 移液管在預(yù)冷的0.1%BSA的DPBS的培養(yǎng)皿或 50mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以產(chǎn)生機(jī)械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液進(jìn)行70μm濾網(wǎng)過濾。

4.7 收集：收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，300g 離心力 4℃離心3min。

4.8 計(jì)數(shù)：棄上清，使用1mL0.1%BSA的DPBS重懸組織沉淀，取20μL 懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300g 離心力 4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

4.9 用適量的Matrigengel Matrix重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10μL Matrigengel Matrix懸液包含70至100個(gè)隱窩，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過30s以避免Matrigengel Matrix過早凝固。

注意： Matrigengel Matrix稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigengel Matrix的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

4.10 將  Matrigengel Matrix和組織細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正中央，每孔 30μL 左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止 Matrigengel Matrix室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

4.11 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待 Matrigengel Matrix 凝固。

待 Matrigengel Matrixwanquan凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的小鼠小腸類器官wanquan培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

4.12將24孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.13每3天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)避免破壞 Matrigengel Matrix。

4.14密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類器官應(yīng)在5至7天內(nèi)建成。