SURE 電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)10cfu/μg DNA 以上?；蛐蜑?endAl glnV44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recBrecJ sbcC umuC::Tn5 uvrC e14-Δ(mcrCBhsdSMR-mrr)171 F'[ proAB' lacIq lacZΔM15 Tn10]

產(chǎn)品特點(diǎn):

克隆不穩(wěn)定 DNA結(jié)構(gòu)，克隆顛倒重復(fù)的DNA 和Z-DNA等;適合克隆甲基化 DNA;

具有 Kana 和 Tet抗性;ANB

用于藍(lán)白斑篩選。

操作步驟:

以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行:

1.0.1cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5min待其瀝千水分,正置5min,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5cm 以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5min充分降溫。2.取-70℃保存的SURE 電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5min,待其融化,加入目的DNA(質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手boda離心管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。A.測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1μl 0.1ng/μl 的對(duì)照質(zhì)粒pUC19;

B.對(duì)于連接產(chǎn)物,請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10mM Tris-HCl,pH7.5;1mM EDTA)重懸DNA濃度不超過100ng/μl,體積

.加入 DNA 時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

2.電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

3.DNA加入到細(xì)胞中后,立即進(jìn)行電擊操作;電擊完成后立刻加上LB或SOC等復(fù)蘇培養(yǎng)基,每分鐘延遲加入

會(huì)導(dǎo)致3倍轉(zhuǎn)化效率的降低。

4.電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo),增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

5.當(dāng) DNA 不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時(shí),轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

6.若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率,推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降

一個(gè)數(shù)量級(jí)。

7.對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,最好轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液(10mM Tris HCl, pH7.5 1mM

EDTA)重懸產(chǎn)物,保證DNA濃度不超過100ng/ul過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率.

增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

8.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作,吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)不可用孔徑過小的槍頭(普通200μl槍頭應(yīng)剪去槍頭尖0.6cm)

避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜,降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終

用于涂板的菌量。

9.電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-70℃以下,高于-70℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。