正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                            

測定意義：

GDH  廣泛分布于植物中，和guansuan合成酶（GOGAT）共同參與guansuan的合成，在氨同化和轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮化合物的代謝中起重要作用。

測定原理：

GDH催化NH₄⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成guansuan和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通過測定340nm吸光度的下降速率，計(jì)算GDH活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

（1）在試劑二中加入25ml試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后12h內(nèi)用完）；

（2）取0.05ml樣本和0.95ml工作液于1ml比色皿中，混勻，加工作液的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在340 nm波長下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和5分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

GDH活性計(jì)算：

1、血清（漿）中GDH活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GDH（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=643×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中GDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。