貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 |
SH0084 | 輔酶INAD(H)含量試劑盒(分光光度50T/24S) | 50管/24樣 |
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時(shí),形成大量的 ROS,同時(shí) NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。
測(cè)定原理:
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH,NADH 通過 PMS 的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在 570nm 下檢測(cè)吸光值;而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測(cè)。
組成:
產(chǎn)品名稱 | SH0084-50T/24S | Storage |
酸性提取液 | 50ml | 4℃ |
堿性提取液 | 50ml | 4℃ |
試劑一:液體 | 15ml | 4℃ |
試劑二:液體 | 4ml | 4℃ |
試劑三:粉劑 | 1瓶 | -20℃ |
試劑四:粉劑 | 1瓶 | 4℃ |
試劑五:液體 | 1.8ml | 4℃ |
試劑六:液體 | 30ml | 4℃ |
試劑七:液體 | 50ml | 4℃ |
說明書 | 一份 |
試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存,用時(shí)加入 4ml 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;
試劑四:粉劑×1 瓶,4 ℃保存,用時(shí)加入 4ml 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;
自備儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
NAD+和 NADH 的提取 :
1、 血清(漿)中 NAD+和 NADH 的提取
NAD+的提取:按照血清(漿)體積(ml):酸性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建
議取約 0.1ml 血清(漿),加入 1ml 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);
冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中
和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
NADH 的提取:按照血清(漿)體積(ml):堿性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建
議取約 0.1ml 血清(漿),加入 1ml 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);
冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中
和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、 組織中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g
組織,加入 1ml 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴
中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g
組織,加入 1ml 堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴
中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中和,
混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
3、 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):酸性
提取液體積(ml)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 酸性提取液),
超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min
(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加
入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):堿
性提取液體積(ml)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 堿性提取液),
超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min
(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加
入 500μl 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm,蒸餾水調(diào)零。
加樣表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加樣):