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Cas9 High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的體外 RNA 轉(zhuǎn)錄試劑盒，可高效進(jìn)行 Cas9 sgRNA 的制備。使用本試劑盒時，僅需按照本試劑盒說明書設(shè)計并合成 Target Sense Oligo，每次反應(yīng)可獲得 50-150 μg 的 Cas9 sgRNA。獲得的 Cas9 sgRNA 可應(yīng)用于 CRISPR 分子診斷、基因編輯等。
產(chǎn)品組分
Part A：體外轉(zhuǎn)錄試劑（-20℃保存） | 31902-01（25 T） | 31902-02（50 T） |
● 5 × TranscriptMax Reaction Buffer | 100 μL | 200 μL |
● NTP mix | 200 μL | 400 μL |
● TranscriptMax Enzyme Mix | 55 μL | 110 μL |
○ DEPC-treated Water | 1 mL | 1 mL |
● 2 × PCR Master Mix | 250 μL | 500 μL |
● Cas9 Antisense Oligo | 25 μL | 25 μL |
● Cas9 Control Target Sense Oligo a | 25 μL | 25 μL |
● 2 × DNase Ⅰ Buffer | 625 μL | 1250 μL |
● DNase Ⅰ | 100 μL | 200 μL |
Part B：純化磁珠（4℃保存） | 3620F-01（25 T） | 3620F-02（50 T） |
● Magnetic Beads b | 625 μL | 1250 μL |
a. Cas9 Control Target Sense Oligo 是陽性對照，可與 Cas9 Antisense Oligo 退火延伸后，作為轉(zhuǎn)錄模板使用，用來測試體外轉(zhuǎn)錄體系的效率。在 37℃孵育 30 min 條件下，對照轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系生成的 sgRNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由NanoDrop 測定。在變性條件下進(jìn)行 TBE-Urea gel 電泳，可觀察到 sgRNA 單條帶大小約為 100 nt。
b. 本產(chǎn)品中 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）與 Part A 組分保存條件不同，因此 Part B 組分需單獨(dú)運(yùn)輸！
保存條件
Part A 組分-20℃保存,有效期 1 年。
需自備的實驗物品
PCR 儀
無水乙醇
異丙醇
無核酸酶水
96 孔磁力架
96 孔板或 PCR 8 聯(lián)排管
移液器及吸頭
Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計
1.Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖
Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖如圖 1 所示,試劑盒中已提供 Cas9 Antisense Oligo,只需根據(jù)待測目標(biāo)序列設(shè)計 Target Sense Oligo 即可。
圖 1. Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖
2.Target Sense Oligo 設(shè)計舉例
2.1 選取 20 bp 的 Target Sequence,其中方框部分為 PAM 序列,下劃線部分為 Target Sequence。
2.2 根據(jù)選取的 Target Sequence 設(shè)計 Target Sense Oligo,則其序列應(yīng)為:
其中雙下劃線為保護(hù)堿基,波浪線部分為 T7 Promoter 序列,下劃線部分為 Target Sequence反向互補(bǔ)序列,如果 Target Sequence 反向互補(bǔ)序列第一個字母是 G 堿基,則可以和 T7 Promoter 序列共用一個 G 堿基。下劃虛線部分為 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。
2.3 轉(zhuǎn)錄得到的 Cas9 sgRNA 序列應(yīng)為:
下劃線部分為 Target Sequence反向互補(bǔ)序列,波浪線部分為 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。
實驗流程
1.DNA 轉(zhuǎn)錄模板制備
Cas9 Antisense Oligo 與 Target Sense Oligo 退火延伸反應(yīng)完成后便可作為轉(zhuǎn)錄模板使用。
1.1 退火體系配制
組分 | 體積 |
2 × PCR Master Mix | 10 μL |
Cas9 Antisense Oligo (10μM) | 0.5 μL |
Target Sense Oligo (10μM) | 0.5 μL |
DEPC-treated Water | 9 μL |
1.2 PCR 退火延伸程序設(shè)置
溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
95℃ | 2 min | × 1 |
95℃ | 15 s | × 5 |
55℃ | 15 s | |
72℃ | 10 s | |
25℃ | Hold on |
2.Cas9 sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄
2.1 按下表試劑的順序進(jìn)行反應(yīng)體系的配制。
組分 | 體積 |
5 × TranscriptMax Reaction Buffer | 4 μL |
NTP mix | 8 μL |
TranscriptMax Enzyme Mix | 2.1 μL |
DEPC-treated Water | 0.9 μL |
DNA 轉(zhuǎn)錄模板 | 5 μL |
· 請將試劑解凍并混勻后再使用。
· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺,而亞精胺與核酸容易形成復(fù)合體沉淀,DNA 轉(zhuǎn)錄模板盡量最后加入到體系中。
· 上述反應(yīng)體系的總體積為 20 μL,可適當(dāng)?shù)缺壤{(diào)整反應(yīng)體系。
2.2 將上述試劑充分混勻,然后短暫離心,在 37℃下孵育 0.5-1 h 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。
2.3 37℃孵育結(jié)束后,按照下表配制 30 μL 的 DNase Ⅰ反應(yīng)液加入到 20 μL 的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中,以去除轉(zhuǎn)錄體系中的 DNA 模板。
組分 | 體積 |
2 × DNase Ⅰ Buffer | 25 μL |
DNase Ⅰ | 4 μL |
DEPC-treated Water | 1 μL |
DNase Ⅰ反應(yīng)條件:37℃,30 min。
3.Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物磁珠純化
3.1 首先將磁珠從 4℃冰箱中取出,在室溫中放置約 30 min,使其溫度平衡至室溫。顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻,吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 異丙醇加入到 50 μL 待純化的 sgRNA 樣品中,用移液器吹打充分混勻。
3.2 室溫孵育 5 min,使 RNA 結(jié)合到磁珠上。
3.3 將樣品置于磁力架上 5 min,待溶液澄清后,小心移除上清。
3.4 保持樣品置于磁力架上,加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇,漂洗磁珠,室溫孵育 30 s,小心移除上清。
注:漂洗時使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鮮配制,配制方法舉例如下:分別量取8 mL 無水乙醇和 2 mL Nuclease-free water,混勻后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。
3.5 重復(fù)步驟 4,共漂洗 2 次。
3.6 保持樣品始終處于磁力架上,開蓋空氣干燥磁珠 5 min。
注:磁珠開蓋晾干時要避免過分干燥,如果磁珠出現(xiàn)龜裂,則提示磁珠過分干燥,此時 RNA 的洗脫效率會降低。
3.7 將樣品從磁力架上取出,加入 50 μL Nuclease-free water,用移液器吹打以充分混勻,室溫靜置 5 min。
3.8 將樣品置于磁力架 5 min,待溶液澄清后,小心轉(zhuǎn)移上清至一個新的 Nuclease-free PCR 管中,即得到純化后的 Cas9 sgRNA。
注意事項
1. 本試劑盒制備的 sgRNA 為目前的 SpCas9 sgRNA,如果要制備其它類型的 Cas9 sgRNA,只需要根據(jù) Cas9 sgRNA scaffold 序列重新設(shè)計 Target Sense Oligo 與 Cas9 Antisense Oligo 即可。
2. 本試劑盒中的 Part B 組分(純化磁珠,#3620F)單獨(dú)運(yùn)輸。磁珠保存條件為 2-8℃,嚴(yán)禁凍存和高速離心操作。
3. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著抑制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng),導(dǎo)致 RNA 合成量減少。
4. 實驗過程應(yīng)選用無核酸酶的槍頭和離心管。
