DUAL membrane 系統(tǒng)是DUAL systems BioTech公司開(kāi)發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測(cè)技術(shù).它利用分離的泛素系統(tǒng)(split-ubiquitin)直接檢測(cè)天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上weiyi檢測(cè)膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用NMY51酵母菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋自互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn);此菌株 Transformation marker為:trplleu2-3報(bào)告基因?yàn)?HIS3ADE2和 lacZ第一步通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型報(bào)告基因(HIS3ADE2)進(jìn)行選擇性生長(zhǎng)篩選，進(jìn)一步通過(guò)LacZ報(bào)告基因進(jìn)行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個(gè)獨(dú)立的報(bào)告基因，受不同啟動(dòng)子的調(diào)控，降低假陽(yáng)性幾率。原理:泛素(ubiquitin)分子量很小由76aa殘基組成;泛素作為降解信號(hào)分子，可以連接另外一種蛋白質(zhì)的N端然后被泛素專一性蛋白酶(UBPs)識(shí)別，從而導(dǎo)致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分:N端(Nub)，C端(Cub)。首先，人為地將泛素Nub的3位異liangansuan突變?yōu)間anansuan(NubI突變?yōu)?NubG)。這樣與Cub 的親合力大大降低避免了 Cub和 Nub 自我結(jié)合或接近的可能性。其次，將Cub 部分與人工合成的LexA-VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個(gè)融合蛋白 Cub-LexA-VP16.正常條件下 NubG不與Cub結(jié)合UBPs也不能識(shí)別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子也不會(huì)被切下來(lái)。最后，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成bait融合蛋(bait-cub-LexA-VP16)和prey融合蛋白(prey-NubG)。如果 bait和prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使NubG 和 Cub的相互接近，被UBPs識(shí)別，導(dǎo)致LexA-VP16的解離，進(jìn)入核內(nèi)，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。此系統(tǒng)可使用四種 Bait 質(zhì)粒:pBT3-N,pBT3-SUC,pBT3-STE pBT3-C,篩選標(biāo)志均為L(zhǎng)EU;三種 Prey質(zhì)粒:pPR3-CpPR3-SUCpPR3-STE篩選標(biāo)志均為TRP

操作方法:

1.取100ul冰上融化的NMY51感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5ugCarrier DNA(95100℃5min,快速冰浴，重復(fù)一次)10ul，PEG/LiAc500ul并吸打幾次混勻，30℃水浴 30min(15min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8 次混勻)。

*備注:Carrier DNA加入請(qǐng)?zhí)崆白冃蕴幚?95-100℃ 5min快速冰浴，重復(fù)一次。置于冰浴5min之內(nèi)使用。

2.將管放 42℃水浴 15min(75min 時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3.5000rpm離心40s棄上清ddH400ul重懸離心30s棄上清

4.ddH,O50ul重懸，涂板，29℃培養(yǎng) 48-96h