R5421釀酒酵母菌株為K+/鉀離子缺陷型菌株，在文獻(xiàn)中也稱為CY162MATa型多用于K+鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定試驗(yàn)中，也可用于K+/鉀離子通道或鈉鉀離子泵的鑒定試驗(yàn)。Transformation marker為:ura3leu2，該菌株可以在含有100mMKCl的培養(yǎng)基中正常生長。在含有5-10mM KCl的培養(yǎng)基中生長緩慢，當(dāng)培養(yǎng)基中KCI濃度低于0.5mMR5421(CY162)細(xì)胞停止生長。

操作方法:

1.CarrierDNA在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態(tài)，步驟如下:CarrierDNA放

95℃水浴或金屬浴3min快速插入冰中靜置3min再次放95℃水浴或金屬浴3min快速插入冰中，靜置 3min 以上。

*備注:Carrier DNA加入請?zhí)崆白冃蕴幚?95-100℃5min快速冰浴重復(fù)一次置于冰浴5min之內(nèi)使用

2.取100u冰上融化的 R5421感受態(tài)細(xì)胞依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒0.5-3ugCarrier DNA 10ul PEG/LiAc 500ul并吸打幾次混勻30℃水浴 30min(15min時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻)。

3.將管放42℃水浴15min(75min 時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

4.5000rpm離心40s棄上清ddH400ul重懸，離心30s棄上清。5ddH 50ul重懸，涂板、29℃培養(yǎng) 48-96h

注意事項(xiàng):

1.感受態(tài)細(xì)胞zuihao在冰上融化。

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3.同時(shí)轉(zhuǎn)化 2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量

4R5421酵母菌株對高溫敏感zuishi生長溫度為27-30℃高于31℃生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。