INVSc1菌株是專門用來做重組蛋白表達(dá)的宿主酵母,pYES2 質(zhì)粒與INVSC1酵母配套使用,激活pYES2質(zhì)粒的GALI啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而啟動(dòng)下游重組蛋白的表達(dá)。INVScl為合子型,可直接通過 PEG/LiAc 將pYES2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入INVSC1 細(xì)胞內(nèi)。質(zhì)粒pYES2的篩選標(biāo)志為 URA,可用 SD-URA板進(jìn)行篩選。操作方法:

1.取100ul冰上融化的INVScl 感受態(tài)細(xì)胞,依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒 2-5ug，CarrierDNA(95

100℃5min,快速冰浴,重復(fù)一次)10ul，PEG/LiAc 500ul并吸打幾次混勻,30℃水浴 30min(15min 時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻)。

*備注:CarrierDNA加入請?zhí)崆白冃蕴幚?25-100 5min,快速冰浴,重復(fù)一次。置于冰浴5min之內(nèi)使用。

2.將管放 42℃水浴 15min(7.5 min 時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻)。

3.5000rpm 離心40s棄上清，ddHO400ul重懸,離心30s棄上清。

4.ddH,O 50ul 重懸,涂質(zhì)粒篩選用:SD-U medium 板,29℃培養(yǎng) 48-96 h。

注意事項(xiàng):

1.感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3.同時(shí)轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4.INVSC1酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為 27-30℃:高于 31℃,生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5.菌落變粉不是污染,是酵母細(xì)胞生長中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后,平板上的 Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成 Adenine 以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞。Adenine 合成途徑受阻:又由于其 ADE4.5.6.7.8 基因均正常,所以造成中間產(chǎn)物 P-ribosvlamino imidazole(AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比 YPDA培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉(zhuǎn)化涂

板為例:涂 YPDA 平板 29℃:48h培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆:涂SD 單缺平板 29℃.48-60h培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆，涂 SD 雙缺平板 29℃,60-80h培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃,80-90h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆。