貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
YW023 | Co-IP試劑盒 |
1.產(chǎn)品概述
免疫共沉淀Co-IP(Co-Immunoprecipitation)是基于抗體和抗原之間結合的專一性用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法。其原理是細胞在非變性條件下被裂解時,細胞內(nèi)存在的蛋白質與蛋白質相互作用體被保留下來,然后利用目標蛋白質特異性抗體進行免疫沉淀。沉淀得到的蛋白質復合體能夠通過變性凝膠電泳分離開來,以此定性或定量分析幾種蛋白質間相互作用。
2.試劑
Reagents | Volume | Storage |
Cell lysis buffer | 35 mL | 4℃ |
Protein A/G-Beads | 800 μL | 4℃ |
Wash buffer I | 15 mL | 4℃ |
Wash buffer II | 15 mL | 4℃ |
Elution buffer | 8 mL | 4℃ |
Neutralization buffer | 800 μL | 4℃ |
Protease inhibitor | 200 μL | -20℃ |
3.材料
Poly Mac Tips 35個
4.實驗步驟
1. 蛋白提取
1) 細胞樣本
1 洗滌:預冷的 1 ml 1×PBS 洗滌樣品(約 1×107個細胞)2 次,最后一次吸干 1×PBS;
2 裂解:根據(jù)細胞量加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors,冰上充分裂解 20~30 min,期間顛倒混勻 3 次,再超聲3次,每次5 sec。
3 離心:4℃,13000 g,15 min,收集上清;
4 測BCA,將收集的上清用Cell lysis buffer稀釋到1ug/ul。
2) 組織樣本
1 研磨:取新鮮組織或深低溫組織(不少于 0.3g),置于研缽中,用液氮進行研磨,轉移組織粉末至新的 EP 管中;
2 裂解:加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors,冰上充分裂解 20~30min,期間顛倒混勻 3 次;
3 離心:4℃,13000 g,15 min,收集上清。
4 測BCA,將收集的上清用Cell lysis buffer稀釋到1ug/ul。
2.蛋白與抗體孵育
1 將步驟 1 得到的樣品,取 100 μL 作為 Input 組,取 900 μL 作為 IP 組,Input 組-80℃保存待用,IP 組管加入 2~5 μg 目的抗體;
2 4℃,垂直混勻器搖動孵育過夜。
(一般每個IP樣本需200-500μl細胞裂解物,濃度在1μg/μL左右,以下步驟以200μl細胞裂解物進行IP為例)
3. Protein-A/G 磁珠懸液準備
1 取 20 ul Protein A/G-Beads,4℃,瞬離棄上清;
2 加入 500 ul 預冷的Cell lysis buffer,混勻,瞬離棄上清,再重復洗滌 1 次;
3 用 100 ul 預冷的Cell lysis buffer 將 Protein A/G-Beads 配成懸液。
4. Protein-A/G 磁珠與抗體結合
1 取步驟 3 得到的 100 μL Protein A/G-Beads 懸浮液加入到 IP 組 EP 管中,4℃,垂直混勻器搖動 2~3 h;
5.洗滌、洗脫
1 將步驟 4 的 IP 組樣品,轉入 Poly Mac Tips中,500rpm,60 ses;
2 加入200ul Wash buffer I 轉IP樣品于 Poly Mac Tips中(盡量多的將IP樣品殘留轉移至 Poly Mac Tips中),500 rpm,1 min,再重復洗滌1次。
3 用 200ul Wash buffer II 轉IP樣品于 Poly Mac Tips中(盡量多的將IP樣品殘留轉移至 Poly Mac Tips中),500 rpm,1 min,再重復洗滌1次;
4 棄過濾液,標記新的EP管待用,加入100 ul Elution buffer,500 rpm,40 sec。
5 在收集的樣品中加入10 ul Neutralization buffer。
6 重復4、5步驟,收集220ul樣品,殘余用注射器吹入EP管,渦勻離心,-80℃保存待用。
5. 質譜檢測(選擇一)
6. western blot(選擇二)
8.注意事項
本產(chǎn)品Protease inhibitor 對人體有毒,操作時要特別小心,并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi);
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究使用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
相關產(chǎn)品:
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
YW002 | 外泌體純化試劑盒(SEC) | 2ml |
YW005 | 外泌體提取試劑盒(EVtrap) | 1ml |
YW006 | 蛋白組學前處理試劑盒 | 48T |
YW007 | 重組yidanbaimei(質譜級) | 100 ug×1 |
YW009 | 重組賴氨酰內(nèi)切酶(質譜級) | 20ug×5 |
YW011 | 多肽脫鹽小柱 | 96T |
YW012 | 磷酸肽蛋白(肽段)提取試劑盒 | 5ml |
YW013 | 色譜分析柱(含填料) | 75um*20cm |
YW015 | 支原體檢測試劑盒(PCR法) | 10T |
YW017 | 支原體清除劑 | 200ul |
YW019 | 支原體預防劑 | 500ul |
YW021 | 黑膠蟲清除劑 | 500ul |
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