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基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）構(gòu)成了一族依賴(lài)鋅的內(nèi)肽酶，在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮作用。這些酶負(fù)責(zé)結(jié)締組織的分解，在骨骼重塑，月經(jīng)周期和組織損傷修復(fù)中很重要。雖然很難評(píng)估MMP對(duì)某些病理過(guò)程的確切貢獻(xiàn)，但MMP似乎在關(guān)節(jié)炎的發(fā)展以及癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。MMP傾向于具有多種底物，大多數(shù)家族成員具有降解不同類(lèi)型膠原蛋白以及彈性蛋白，明膠和纖連蛋白的能力。很難找到對(duì)單個(gè)MMP酶具有選擇性的底物。該FRET底物經(jīng)設(shè)計(jì)對(duì)MMP-3具有較高的選擇性。它用于監(jiān)視MMP-3活動(dòng)。當(dāng)使用純化的MMP-3酶時(shí)，它也可用于篩選MMP-3抑制劑。該FRET基板基于我們的TF2 / TQ2 FRET對(duì)。在MMP-3水解后，由于TF2 / TQ2 FRET對(duì)已分離，因此MMP-3 Green™FRET肽底物的熒光增強(qiáng)。熒光增加與MMP-3酶活性成正比。
平臺(tái)
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 490納米 |
| 發(fā)射 | 525納米 |
| 隔斷 | 515納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
組件
| 組件A：MMP-3 Green™基材 | 1小瓶（60 µL） |
| 組分B：APMA，4-氨基苯y(tǒng)i酸汞 | 1小瓶（20 µL，1 M） |
| 組分C：測(cè)定緩沖液 | 1瓶（20毫升） |
協(xié)議范例
乍看上去
協(xié)議摘要
- 添加適當(dāng)?shù)膶?duì)照或測(cè)試樣品（50 µL）
- 預(yù)孵育10-15分鐘
- 添加MMP-3 Green™底物工作溶液（50 µL）
- 跳過(guò)孵育以獲取動(dòng)力學(xué)讀數(shù)，或孵育30至60分鐘以獲取終點(diǎn)讀數(shù)
- 監(jiān)測(cè)Ex / Em = 490/525 nm的熒光強(qiáng)度
重要說(shuō)明
開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊性噭┖薪M件。根據(jù)需要準(zhǔn)備包含MMP-3的生物樣品。
準(zhǔn)備工作溶液
1. MMP-3 Green™底物工作溶液：
將50μLMMP-3 Green™底物（組分A）添加到5 mL的測(cè)定緩沖液（組分C）中，使總體積為5.05 mL。
2. MMP-3稀釋?zhuān)?/em>
如果使用純化的MMP-3，則在測(cè)定緩沖液（組分C）中將MMP-3稀釋至適當(dāng)濃度。注意： MMP-3需要在使用前激活。避免酶劇烈渦旋。
3.抑制劑和化合物的稀釋?zhuān)?/em>
如果要篩選MMP-3抑制劑，請(qǐng)根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)配已知濃度的MMP-3抑制劑和測(cè)試化合物稀釋液。
程序
表1.在96孔微孔板中適當(dāng)?shù)膶?duì)照（根據(jù)需要）和測(cè)試樣品的布局。SC =底物對(duì)照，IC =抑制劑對(duì)照，VC =載體對(duì)照，TC =測(cè)試化合物對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。
| SC | SC | ... | ... |
| 我知道了 | 我知道了 | ||
| 風(fēng)投 | 風(fēng)投 | ||
| TC | TC | ||
| TS | TS | ||
| ... | ... | ||
| ... | ... | ||
表2.每個(gè)孔的試劑組成。注意：某些強(qiáng)熒光測(cè)試化合物可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
| 好 | 體積 | 試劑 |
| SC | 50微升 | 分析緩沖液（組分C） |
| 我知道了 | 50微升 | MMP-3稀釋液和已知的MMP-3抑制劑 |
| 風(fēng)投 | 50微升 | MMP-3稀釋液和用于輸送測(cè)試化合物的載體 |
| TC | 50微升 | 含MMP-3的測(cè)定緩沖液和測(cè)試化合物 |
| TS | 50微升 | 用測(cè)試化合物稀釋MMP-3 |
根據(jù)需要準(zhǔn)備包含MMP-3的生物樣品。
要激活pro-MMP-3，請(qǐng)先用1：500的測(cè)定緩沖液（組分C）稀釋1M APMA（組分B），以獲得2 mM APMA工作溶液（2X）。注意： APMA屬于有機(jī)汞。小心輕放！請(qǐng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)進(jìn)行處理。
接下來(lái)，將含有MMP-3的樣品或純化的MMP-3與等體積的2 mM APMA工作溶液（2X）在37°C下孵育24小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)之前立即激活MMP-3。注意：將含酶的樣品放在冰上。避免劇烈渦旋酶?；罨傅拈L(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存??將使酶失活。為了酶的活化，優(yōu)選以較高的蛋白質(zhì)濃度活化。激活后，您可以進(jìn)一步稀釋該酶。根據(jù)表1和2中提供的布局準(zhǔn)備對(duì)照和測(cè)試樣品（TS）。對(duì)于384孔板，每孔使用20 µL試劑代替50 µL。
- 如果要篩選MMP-3抑制劑，請(qǐng)?jiān)谒璧拿阜磻?yīng)溫度（例如25°C或37°C）下將板預(yù)孵育10-15分鐘。
- 將50 µL（96孔）或20 µL（384孔）的MMP-3 Green™底物工作溶液添加到樣品和測(cè)定板的對(duì)照孔中。充分混合試劑。
- 使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)控?zé)晒鈴?qiáng)度。
對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)：立即開(kāi)始測(cè)量熒光強(qiáng)度，并每5分鐘連續(xù)記錄數(shù)據(jù)30至60分鐘。
對(duì)于終點(diǎn)讀數(shù)：將反應(yīng)在室溫下孵育30至60分鐘，如果可能，請(qǐng)避開(kāi)光線。充分混合試劑，然后測(cè)量熒光強(qiáng)度。
