腺苷3'，5'環(huán)狀單磷酸酯（cAMP）是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要第二信使。監(jiān)測(cè)cAMP水平是篩選GPCR激動(dòng)劑和拮抗劑的zui常用方法之一。Screen Quest™比色ELISA cAMP分析試劑盒基于HRP標(biāo)記的cAMP與未標(biāo)記的cAMP之間的競(jìng)爭(zhēng)。通過未標(biāo)記的游離cAMP將HRP-cAMP從HRP-cAMP /抗cAMP抗體復(fù)合物中置換出來。在不存在cAMP的情況下，HRP-cAMP共軛物僅與抗cAMP抗體結(jié)合。但是，測(cè)試樣品中未標(biāo)記的游離cAMP與HRP-cAMP抗體偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)抗cAMP抗體，因此抑制了HRP-cAMP與抗cAMP抗體的結(jié)合。我們的Screen Quest™比色ELISA cAMP分析試劑盒提供了一種靈敏的方法，用于在生化或基于細(xì)胞的分析系統(tǒng)中檢測(cè)腺苷酸環(huán)化酶的活性。與其他ELISA cAMP分析試劑盒相比，我們的試劑盒省去了繁瑣的乙酰化步驟。該試劑盒使用Amplite™Green作為比色底物來定量HRP活性。該測(cè)定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行。

1. 準(zhǔn)備樣品
2. 將75 µL /孔的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品添加到抗cAMP涂層的96孔板中
3. 在室溫下孵育5-10分鐘
4. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP共軛物
5. 在室溫下孵育3小時(shí)
6. 用200 µL /孔的洗滌緩沖液洗滌4次
7. 添加100 µL /孔的Amplite™Green
8. 在室溫下孵育1至3個(gè)小時(shí)
9. 監(jiān)測(cè)405、650或740 nm處的吸光度增加

重要說明
請(qǐng)勿凍結(jié)Anti-cAMP Ab預(yù)包被的96孔板（組分F），將其保存在4°C下。在使用之前，將所有套件組件加熱至室溫。在運(yùn)輸過程中，某些材料可能會(huì)粘在小瓶蓋上。短暫離心小瓶以收集所有內(nèi)容物。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. cAMP儲(chǔ)備溶液（100 µM）：
將1 mL測(cè)定緩沖液（組分B）加入小瓶cAMP標(biāo)準(zhǔn)液（組分A）。

：2. HRP-cAMP的綴合物原液（50X）
加入55μL（目錄號(hào)36370。或550μL（）目錄號(hào)36371。測(cè)定緩沖液（成分B）的）到HRP-cAMP的結(jié)合物（成分C）的小瓶中。注意：未使用的50X HRP-cAMP共軛原液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在-20 ^o C下保存。

3.洗滌液（1X）：
將1 mL的10X洗滌液（組分D）添加到9 mL蒸餾水中。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見，請(qǐng)使用我們的系列稀釋計(jì)

在測(cè)定緩沖液（組分B）中按1：10、1：100和1：3的比例連續(xù)稀釋cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP稀釋溶液。存放在冰上或4°C下。

準(zhǔn)備工作溶液

HRP-cAMP偶聯(lián)物工作液：
使用前，用測(cè)定緩沖液（組分B）以1:50稀釋，以得到1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作液。存放在冰或4°C下。注意： 25 µL 1X HRP-cAMP共軛物工作溶液足以用于一個(gè)測(cè)定點(diǎn)；準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)捏w積，僅供一次性使用。

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程序

準(zhǔn)備樣品

1. 根據(jù)需要處理細(xì)胞：
   以下是用Forskolin處理以96孔板形式誘導(dǎo)cAMP的Hela細(xì)胞的示例：吸出細(xì)胞生長培養(yǎng)基，在Hanks中加入100 µL /孔100 µM Forskolin和20 mM Hepes緩沖液（HHBS） ），在5％CO ₂和37°C的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘。孵育后吸出細(xì)胞溶液，加入100 µL /孔的細(xì)胞裂解緩沖液（組分E），然后在室溫下孵育另外10分鐘。該細(xì)胞裂解液可以直接測(cè)定，也可以在測(cè)定緩沖液（組分B）中稀釋后測(cè)定。注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定*細(xì)胞密度。取決于細(xì)胞類型和/或測(cè)試化合物的作用，可以在實(shí)驗(yàn)的前一天或?qū)嶒?yàn)當(dāng)天將細(xì)胞接種。
    
2. 組織樣品：
   由于組織中環(huán)狀核苷酸的快速代謝，收集后迅速冷凍組織（例如使用液氮）非常重要。稱重冷凍的組織，并添加10-20 µL / mg細(xì)胞裂解緩沖液。在冰上均質(zhì)樣品。高速旋轉(zhuǎn)5分鐘并收集上清液。上清液可以直接測(cè)定。
    
3. 尿液，血漿和培養(yǎng)基樣品：
   尿液和血漿可以直接在1X裂解緩沖液中以1：200至1：1000的稀釋度進(jìn)行測(cè)試。培養(yǎng)基也可以在裂解緩沖液中以1:10至1：200的稀釋度進(jìn)行測(cè)試。注意： RPMI介質(zhì)可能包含> 350 fmol / µL cAMP。

cAMP分析

1. 所有測(cè)定孔均按以下順序準(zhǔn)備：A）cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照或測(cè)試樣品；B）HRP-cAMP共軛物。
    
2. 將75 µL /孔的cAMP稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液和測(cè)試樣品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（組分F）的每個(gè)孔中。我們建議對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品重復(fù)測(cè)定。在室溫下孵育5至10分鐘。
    
3. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP共軛工作溶液。將板放在搖床上，在室溫下孵育3小時(shí)。
    
4. 吸出板內(nèi)容物，并用200 µL /孔的1X洗滌液洗滌4次。
    
5. 在每個(gè)孔中加入100 µL /孔的Amplite™Green（組分G），并在避光的條件下在室溫下孵育60分鐘至3小時(shí)。
    
6. 使用吸光度板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)405 nm，650 nm或740 nm處的吸光度增加。

   36370	Screen Quest™cAMP檢測(cè)試劑盒*比色ELISA法*	Screen Quest™ Colorimetric ELISA cAMP Assay Kit	1 plate
   36371	Screen Quest™cAMP檢測(cè)試劑盒*比色ELISA法*	Screen Quest™ Colorimetric ELISA cAMP Assay Kit	10 plates
   36373	Screen Quest™cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光ELISA法*	Screen Quest™ Fluorimetric ELISA cAMP Assay Kit	1 plate
   36374	Screen Quest™cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光ELISA法*	Screen Quest™ Fluorimetric ELISA cAMP Assay Kit	10 plates
   36379	Screen Quest™免洗cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法*	Screen Quest™ FRET No Wash cAMP Assay Kit	1 plate
   36380	Screen Quest™免洗cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法*	Screen Quest™ FRET No Wash cAMP Assay Kit	10 plates
   36381	Screen Quest™免洗cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法*	Screen Quest™ FRET No Wash cAMP Assay Kit	50 plates