三磷酸腺苷（ATP）在細(xì)胞能量，代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著基本作用。ATP的定量可用于多種生物學(xué)應(yīng)用。因?yàn)锳TP是幾乎所有活生物體的能量來(lái)源，但在沒(méi)有活生物體的情況下會(huì)迅速降解，因此它的存在可以用來(lái)確定活生物體的存在。ATP的測(cè)量已用于細(xì)胞的細(xì)胞毒性，表面細(xì)菌的檢測(cè)，水中細(xì)菌的定量，培養(yǎng)物中的體細(xì)胞和食品質(zhì)量。McElroy*提出使用螢火蟲(chóng)生物發(fā)光法測(cè)量ATP，當(dāng)時(shí)他發(fā)現(xiàn)ATP對(duì)于產(chǎn)生光至關(guān)重要。螢火蟲(chóng)螢光素酶是一種單體的61 kD酶，可催化螢光素的兩步氧化，產(chǎn)生560 nm的光。di一步涉及通過(guò)ATP激活蛋白質(zhì)，以生成反應(yīng)性混合酸酐中間體。在第二步中，活性中間體與氧氣反應(yīng)生成瞬態(tài)二氧雜環(huán)丁烷，該瞬態(tài)二氧雜環(huán)丁烷迅速分解為氧化產(chǎn)物氧化熒光素和二氧化碳以及一束光。當(dāng)ATP是限制性成分時(shí)，光強(qiáng)度與ATP濃度成正比。因此，可以使用光度計(jì)將光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果用于定量ATP。AAT Bioquest的ReadiUse™快速發(fā)光ATP分析試劑盒（不含DTT）以即用形式提供了所有必需成分。它提供了一種快速，簡(jiǎn)單且均一的發(fā)光測(cè)定法，用于監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。該測(cè)定法是基于螢火蟲(chóng)熒光素酶對(duì)ATP和熒光素的催化釋放而進(jìn)行的ATP檢測(cè)。它可以在化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀上以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行。該測(cè)定法極其靈敏，每孔可檢測(cè)50個(gè)細(xì)胞。它具有穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)，半衰期超過(guò)2小時(shí)。此ReadiUse™快速發(fā)光ATP分析試劑盒不使用DTT，從而消除了難聞的氣味。

1. 用測(cè)試化合物（100 µL / 96孔板或25 µL / 384孔板）制備細(xì)胞（樣品）
2. 加入等體積的即用型ReadiUse™快速光度ATP分析試劑（100 µL / 96孔板或25 µL / 384孔板）
3. 在室溫下孵育10-20分鐘
4. 監(jiān)控發(fā)光強(qiáng)度

重要說(shuō)明
為了獲得*效果，強(qiáng)烈建議使用白板。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，在室溫下解凍所有試劑盒的成分。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見(jiàn)，請(qǐng)使用我們的系列稀釋計(jì)

可選，不提供ATP。

用ddH2O或適當(dāng)?shù)木彌_液制備1 mM ATP儲(chǔ)備溶液，然后進(jìn)行系列稀釋以達(dá)到10 pM至10 µM的ATP濃度。

程序

表1.白色96孔微孔板中ATP標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局。SD = ATP標(biāo)準(zhǔn)液，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品

表2.  每個(gè)孔的試劑組成

1. 通過(guò)在所需的化合物緩沖液中加入10 µL的10X化合物（用于96孔板）或5 µL的5X化合物（用于384孔板）來(lái)用測(cè)試化合物處理細(xì)胞（或樣品）。對(duì)于空白孔（沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)基），添加相應(yīng)量的化合物緩沖液。

2. 孵育細(xì)胞板在37 ^ø C，5％CO ₂培養(yǎng)箱中的所需時(shí)間，如24，48或96小時(shí)。

3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的ReadiUse™快速光度ATP分析試劑。
    
4. 在室溫下孵育10-20分鐘。注意： 將未使用的ReadiUse™快速發(fā)光ATP分析試劑分裝并儲(chǔ)存在-20 ^o C，并避免重復(fù)的冷凍/解凍循環(huán)。

4. 使用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)光計(jì)監(jiān)控發(fā)光強(qiáng)度。

數(shù)據(jù)分析

4e+42e+48.0e+36.0e+34.0e+32.0e+3- 2 hr- 15 minData legendGenerated with Quest Graph™Cell (#/well)RLUX: 2.13e+3Hover mouse to interactY: 1.3e+4Y: 1.3e+4Y: 1.1e+4Y: 1.1e+4

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RLU）用作陰性對(duì)照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計(jì)算細(xì)胞樣品