乳酸脫氫酶（LDH）是一種氧化還原酶，可催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化。LDH存在于包括動物和植物在內(nèi)的多種生物的細(xì)胞質(zhì)中。組織損傷或紅細(xì)胞溶血后，細(xì)胞將LDH釋放到血液中。由于LDH是一種相當(dāng)穩(wěn)定的酶，它已被廣泛用于評估組織和細(xì)胞的損傷和毒性。LDH的定量分析具有廣泛的應(yīng)用。LDH在某些病理狀況（例如癌癥）中也會升高。該Amplite™乳酸脫氫酶測定試劑盒提供了一種基于熒光的方法，用于檢測血清，血漿，尿液以及細(xì)胞培養(yǎng)樣品等生物樣品中的D-乳酸脫氫酶（D-LDH）。在酶聯(lián)測定中，LDH與熒光性NADH傳感器專門監(jiān)測的NADH濃度成正比關(guān)系。該測定法對D-LDH是特異性的。熒光信號可以通過熒光酶標(biāo)儀讀取。使用這種熒光Amplite™D-乳酸脫氫酶測定試劑盒，我們能夠在100 µL反應(yīng)體積中檢測到低至1 mU / mL D-乳酸脫氫酶。

1. 準(zhǔn)備D-乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50 µL）
2. 加入D-乳酸脫氫酶工作溶液（50 µL）
3. 在室溫下孵育30分鐘-2小時
4. 監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570nm）的熒光增加

重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍每種試劑盒成分之一。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. NAD儲備溶液（100X）：
將100 µL H ₂ O加入NAD小瓶（組分C）中，制成100X NAD儲備溶液。

2. D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 U / mL）：
將100 µL H ₂ O或1x PBS緩沖液加到D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液（組分D）的小瓶中，制成100 U / mL D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

將10 µL 100 U / mL D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到990 µL 1x PBS緩沖液中，以生成1000 mU / mL D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1000 mU / mL D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在PBS中進(jìn)行1：3系列稀釋，以得到D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液（SD7-SDH1）的系列稀釋液。 注意：稀釋的D-LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。

準(zhǔn)備工作溶液

1.將10 mL測定緩沖液（組分B）添加到瓶中的酶探針（組分A）中，制成酶探針混合物。 注意：  此酶探針混合物足以容納兩個96孔板。

2.將50 µL 100X NAD儲備溶液添加到5 mL酶探針混合物中，并充分混合以制成D-LDH工作溶液。注意：此D-LDH工作溶液足以用于一個96孔板。它不穩(wěn)定-足以進(jìn)行一個實驗并立即使用。

程序

表1.  黑色96孔微孔板中D-LDH標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。SD = D-LDH標(biāo)準(zhǔn)品（SD1-SD7，0.3至300 mU / mL），BL =空白對照，TS =測試樣品。 

表2.  每個孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和2中提供的布局，準(zhǔn)備D-LDH標(biāo)準(zhǔn)品（SD），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑而不是50 µL 。
    
2. 將50 µL D-LDH工作溶液添加到D-LDH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中，以使D-LDH測定總體積為100 µL /孔。對于384孔板，將25 µL D-LDH工作溶液加到每個孔中，總體積為50 µL /孔。
    
3. 在避光的條件下，將反應(yīng)在室溫下孵育30分鐘至2小時。
    
4. 使用熒光板讀數(shù)器在激發(fā)= 530-570 nm，發(fā)射= 590-600 nm（*Ex / Em = 540/590 nm，截止在570 nm）下監(jiān)測熒光的增加。注意：該板的內(nèi)容，也可以在A的比例轉(zhuǎn)移到白色透明底板和讀通過吸光度酶標(biāo)儀_575nm處 / A _605nm。與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測的靈敏度較低。

數(shù)據(jù)分析

1e+4100010010010- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™D-Lactate Dehydrogenase (mU/mL)RFUX: 50.324Hover mouse to interactY: 2.99e+3Y: 2.99e+3

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計算D-乳酸脫氫酶樣品。