Amplite™熒光20S蛋白酶體測定試劑盒是一種均相熒光測定法，可測量培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中與蛋白酶體復(fù)合物相關(guān)的yiningrudanbaimei樣蛋白酶活性。該試劑盒使用LLVY-R110作為蛋白酶體活性的熒光指示劑。蛋白酶體切割LLVY-R110會生成強綠色熒光R110，該熒光在480-500 nm激發(fā)下以520-530 nm進(jìn)行熒光檢測。該試劑盒可提供所有必需成分，并具有優(yōu)化的測定方案。該測定是魯棒的，并且可以容易地適用于高通量測定，以評估蛋白酶體活性或在培養(yǎng)的細(xì)胞或溶液中篩選抑制劑。該測定可以以方便的96孔和384孔熒光微量滴定板形式進(jìn)行。蛋白酶體的主要功能是通過蛋白水解作用降解不需要的或受損的蛋白質(zhì)，這種化學(xué)反應(yīng)會破壞肽鍵。蛋白酶體降解途徑對于許多細(xì)胞過程至關(guān)重要，包括細(xì)胞周期，基因表達(dá)的調(diào)控以及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。該途徑中常見的蛋白酶體形式是26S蛋白酶體，這是一種ATP依賴性蛋白水解復(fù)合物，包含一個20S（700-kDa）核心顆粒結(jié)構(gòu)和兩個19S（700-kDa）調(diào)節(jié)帽。20S核心包含三種主要的蛋白水解活性，包括midanbaimei樣，yidanbaimei樣和胱天蛋白酶樣。它負(fù)責(zé)與凋亡，DNA修復(fù)，內(nèi)吞作用和細(xì)胞周期控制有關(guān)的關(guān)鍵蛋白的分解。破壞肽鍵的化學(xué)反應(yīng)。蛋白酶體降解途徑對于許多細(xì)胞過程至關(guān)重要，包括細(xì)胞周期，基因表達(dá)的調(diào)控以及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。該途徑中常見的蛋白酶體形式是26S蛋白酶體，這是一種ATP依賴性蛋白水解復(fù)合物，包含一個20S（700-kDa）核心顆粒結(jié)構(gòu)和兩個19S（700-kDa）調(diào)節(jié)帽。20S核心包含三種主要的蛋白水解活性，包括midanbaimei樣，yidanbaimei樣和胱天蛋白酶樣。它負(fù)責(zé)與凋亡，DNA修復(fù)，內(nèi)吞作用和細(xì)胞周期控制有關(guān)的關(guān)鍵蛋白的分解。破壞肽鍵的化學(xué)反應(yīng)。蛋白酶體降解途徑對于許多細(xì)胞過程至關(guān)重要，包括細(xì)胞周期，基因表達(dá)的調(diào)控以及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。該途徑中常見的蛋白酶體形式是26S蛋白酶體，這是一種ATP依賴性蛋白水解復(fù)合物，包含一個20S（700-kDa）核心顆粒結(jié)構(gòu)和兩個19S（700-kDa）調(diào)節(jié)帽。20S核心包含三種主要的蛋白水解活性，包括midanbaimei樣，yidanbaimei樣和胱天蛋白酶樣。它負(fù)責(zé)與凋亡，DNA修復(fù)，內(nèi)吞作用和細(xì)胞周期控制有關(guān)的關(guān)鍵蛋白的分解。該途徑中常見的蛋白酶體形式是26S蛋白酶體，這是一種ATP依賴性蛋白水解復(fù)合物，包含一個20S（700-kDa）核心顆粒結(jié)構(gòu)和兩個19S（700-kDa）調(diào)節(jié)帽。20S核心包含三種主要的蛋白水解活性，包括midanbaimei樣，yidanbaimei樣和胱天蛋白酶樣。它負(fù)責(zé)與凋亡，DNA修復(fù)，內(nèi)吞作用和細(xì)胞周期控制有關(guān)的關(guān)鍵蛋白的分解。該途徑中常見的蛋白酶體形式是26S蛋白酶體，這是一種ATP依賴性蛋白水解復(fù)合物，包含一個20S（700-kDa）核心顆粒結(jié)構(gòu)和兩個19S（700-kDa）調(diào)節(jié)帽。20S核心包含三種主要的蛋白水解活性，包括midanbaimei樣，yidanbaimei樣和胱天蛋白酶樣。它負(fù)責(zé)與凋亡，DNA修復(fù)，內(nèi)吞作用和細(xì)胞周期控制有關(guān)的關(guān)鍵蛋白的分解。

組件

1. 用測試化合物制備細(xì)胞（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）

2. 加入等體積的蛋白酶體工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）

3. 在37°C或室溫下孵育至少1小時

4. 監(jiān)測Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）的熒光強度

重要說明
使用前，請在室溫下解凍所有套件組件。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1.蛋白酶體LLVY-R110底物原液（400X）：
將25 µL DMSO（組分C）添加到蛋白酶體LLVY-R110底物（組分A）的小瓶中，并充分混合以制成400X蛋白酶體LLVY-R110底物原液。

準(zhǔn)備工作溶液

將25μL400X蛋白酶體LLVY-R110底物儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分B）中，并充分混合以制成蛋白酶體工作液。注意：  此蛋白酶體工作溶液足以裝一盤。避光。

程序

1. 用10 µL 10X測試化合物（用于96孔板）或5 µL 5X測試化合物（用于384孔板）在PBS或所需緩沖液中處理細(xì)胞。對于空白孔（沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基），添加相應(yīng)量的化合物緩沖液。
   

2. 將細(xì)胞板在5％CO ₂和37°C的培養(yǎng)箱中孵育所需的時間。注意：純蛋白酶體或細(xì)胞裂解液可直接用于篩選蛋白酶體抑制劑。
   

3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的蛋白酶溶液。
   

4. 在避光的條件下，將板在37°C或室溫下孵育至少1小時（2小時至過夜）。注意：應(yīng)單獨評估每個細(xì)胞系，以確定*孵育時間。
   

5. 監(jiān)測Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）的熒光強度（zui高讀數(shù)）。

   13456	Amplite™熒光法蛋白酶體20S活性檢測試劑盒 *綠色熒光*	Amplite™ Fluorimetric Proteasome 20S Activity Assay Kit *Green Fluorescence*	100 tests
   13457	蛋白酶熒光底物Pro-AMC	Pro-AMC	5 mg
   13458	蛋白酶熒光底物Ala-AMC	Ala-AMC	5 mg
   13459	蛋白酶熒光底物D-Ala-AMC	D-Ala-AMC *CAS 201847-52-1*	5 mg
   13460	yiningrudanbaimei熒光底物MeO-Succ-Arg-Pro-Tyr-AMC	MeO-Succ-Arg-Pro-Tyr-AMC	5 mg
   13461	yiningrudanbaimei熒光底物BOC-Val-Pro-Arg-AMC	BOC-Val-Pro-Arg-AMC	5 mg