腸激酶（也稱為腸肽酶）是由十二指腸壁細(xì)胞產(chǎn)生的siansuan蛋白酶，是人和動(dòng)物消化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶。腸激酶將yidambaimei原轉(zhuǎn)化為yidanbaimei的活性形式，從而導(dǎo)致胰腺消化酶的后續(xù)活化。腸激酶的缺乏會(huì)導(dǎo)致腸道消化功能障礙。腸激酶的抑制可能通過抑制與癌變和轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白酶而具有抗腫瘤作用。因此，腸激酶的高選擇性和靈敏檢測(cè)在生化應(yīng)用中起著關(guān)鍵作用。Amplite™比色腸激酶活性測(cè)定試劑盒提供了用于定量腸激酶活性的靈敏測(cè)定。

協(xié)議摘要

1. 準(zhǔn)備測(cè)試樣品和腸激酶標(biāo)準(zhǔn)液（50 µL）

2. 加入等體積的腸激酶工作溶液（50 µL）

3. 在37°C下孵育30-60分鐘

4. 監(jiān)測(cè)405 nm處的吸光度增加

重要說明
開始實(shí)驗(yàn)前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒成分的小瓶。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. EK Yellow™儲(chǔ)備溶液（100X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到EK Yellow™（組分A）中，制成100X儲(chǔ)備溶液。

2.腸激酶底物原液（100X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到腸激酶底物（組分B）中制成100X原液。

3.腸激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 µg / mL）：
將50 µL ddH ₂ O + 0.1％BSA加入腸激酶標(biāo)準(zhǔn)小瓶（組分D）中，制成10 µg / mL腸激酶儲(chǔ)備液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見，請(qǐng)使用我們的系列稀釋計(jì)

將10 µL的10 µg / mL腸激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液加到990 µL的測(cè)定緩沖液（組分C）中，得到100 ng / mL的腸激酶溶液（EK7）。然后在測(cè)定緩沖液中進(jìn)行1：2的連續(xù)稀釋以獲得連續(xù)稀釋的腸激酶標(biāo)準(zhǔn)品（EK6-EK1）。注意： EK標(biāo)準(zhǔn)僅用于陽性對(duì)照，不應(yīng)作為酶活性的定量標(biāo)準(zhǔn)。

準(zhǔn)備工作溶液

將50 µL EK Yellow™儲(chǔ)備溶液和50 µL腸激酶底物儲(chǔ)備溶液加入5 mL的測(cè)定緩沖液（組分C）中；充分混合以制成腸激酶（EK）工作溶液（組分A + B + C）。注意：分析混合物足以用于一塊96孔板。它不穩(wěn)定，請(qǐng)及時(shí)使用。

程序

表1.在96孔透明底部微孔板中腸激酶標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局。EK =腸激酶標(biāo)準(zhǔn)品（EK1-EK7，1.56至100 ng / mL）; BL =空白對(duì)照；TS =測(cè)試樣品。

表2.每個(gè)孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和表2提供的布局，將腸激酶標(biāo)準(zhǔn)品（EK），空白對(duì)照（BL）和測(cè)試樣品（TS）準(zhǔn)備到96孔透明底部微孔板中。對(duì)于384孔板，請(qǐng)使用25 µL每孔試劑，而不是50 µL。
   

2. 將50 µL EK工作溶液添加到腸激酶標(biāo)準(zhǔn)液，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中，使總測(cè)定體積為100 µL /孔。對(duì)于384孔板，將25 µL EK工作溶液添加到每個(gè)孔中，總體積為50 µL /孔。
   

3. 將反應(yīng)混合物在37°C下孵育30-60分鐘。
   

4. 用吸光度板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)吸光度的增加，并在OD 405 nm處進(jìn)行路徑檢查。

數(shù)據(jù)分析

0.110- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Enterokinase (ng/mL)AbsorbanceHover mouse to interact

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（吸光度）用作陰性對(duì)照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計(jì)算腸激酶樣品。