我們的Amplite™Red是一種敏感的熒光過氧化物酶底物，可產(chǎn)生高度紅色的熒光產(chǎn)物，zui大吸收量為571 nm，zui大發(fā)射量為585 nm。與其他HRP底物（例如二氫熒光素和二氫羅丹明）不同，Amplite™Red的空氣氧化作用極小。Amplite™Red是用于檢測(cè)HRP和H2O2的zui靈敏，穩(wěn)定的熒光探針之一。在許多免疫測(cè)定中，Amplite™Red已被廣泛用于檢測(cè)HRP。另一方面，Amplite™Red也可以用于檢測(cè)痕量的H2O2?；贏mplite™Red的H2O2檢測(cè)靈敏度比常用的大麥草堿H2O2檢測(cè)靈敏度高至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。由于H2O2是在許多酶促氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的，

平臺(tái)

帶有Amplite ^TM Red的過氧化物酶（HRP）的方案摘要（用于一個(gè)96孔黑色板）

1. 準(zhǔn)備并添加1X Amplite ^TM Red工作溶液和200 mM H ₂ O ₂的磷酸鹽緩沖液（50 µL）

2. 加入過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50 µL）

3. 在室溫下孵育10-30分鐘

4. 監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm的熒光強(qiáng)度

重要說明
以下是溶液中過氧化物酶測(cè)定的推薦方案。該協(xié)議僅提供指南，應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行修改。

開始實(shí)驗(yàn)前，在室溫下解凍每種試劑盒成分之一。

帶有Amplite ^TM Red的H ₂ O _2的協(xié)議摘要（用于一個(gè)96孔黑色平板）

1. 用磷酸鹽緩沖液（50 µL）中的0.4 U / mL過氧化物酶制備1X Amplite ^TM Red H ₂ O ₂工作溶液

2. 加入過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50 µL）

3. 在室溫下孵育10-30分鐘

4. 監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm的熒光強(qiáng)度

重要說明
以下是溶液中H ₂ O ₂分析的推薦方案。該協(xié)議僅提供指南，應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行修改。

開始實(shí)驗(yàn)前，在室溫下解凍每種試劑盒成分之一。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

Amplite ^TM Red儲(chǔ)備液（250X）：
將200 mL無水DMSO加入小瓶中，充分混合。儲(chǔ)備溶液應(yīng)及時(shí)使用。任何未使用的溶液都應(yīng)等分并在< -20 ^o處冷凍。注意：避免重復(fù)的凍融循環(huán)，并避光。

準(zhǔn)備工作溶液

1. Amplite ^TM Red過氧化物酶工作溶液（1X）：在5 mL的50 mM磷酸鹽緩沖液或您選擇的pH 200為_2的 H ₂ O _2的緩沖液中
加入20μLAmplite ^TM Red儲(chǔ)備液（250X）。 注意：在DTT和b-巰基乙醇等硫醇存在下，Amplite ^TM Red不穩(wěn)定。高于10μM（zui終濃度）的硫醇會(huì)顯著降低測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍。NADH和guguanggantai（從GSH還原）可能會(huì)干擾測(cè)定。2. Amplite ^TM Red H ₂ O ₂工作溶液（1倍）：添加20μLAmplite ^TM


紅色儲(chǔ)備液（250X）溶于5 mL 50 mM磷酸鹽緩沖液或您選擇的緩沖液，pH 7，含0.4單位/ mL過氧化物酶。 注意：在DTT和b-巰基乙醇等硫醇存在下，Amplite ^TM Red不穩(wěn)定。高于10μM（zui終濃度）的硫醇會(huì)顯著降低測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍。NADH和guguanggantai（從GSH還原）可能會(huì)干擾測(cè)定。

程序

上清液中的過氧化物酶測(cè)定

1. 將50 µL 1X Amplite ^TM Red過氧化物酶工作溶液添加到過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中，使總過氧化物酶測(cè)定體積為100 µL /孔。 注意：對(duì)于384孔板，請(qǐng)在每個(gè)孔中加入25 µL樣品和25 µL 1X Amplite ^TM Red過氧化物酶工作溶液。
   

2. 在避光條件下，室溫下孵育反應(yīng)10至30分鐘。
   

3. 使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm處的熒光增加。
   

4. 空白孔（僅使用分析緩沖液）中的熒光用作對(duì)照，并通過過氧化物酶反應(yīng)從那些孔的值中減去。

上清液中的H ₂ O ₂測(cè)定

1. 在H ₂ O ₂標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中加入50 µL 1X Amplite ^TM Red H ₂ O ₂工作溶液，使總H ₂ O ₂分析體積為100 µL /孔。 注意：對(duì)于384孔板，請(qǐng)在每個(gè)孔中加入25 µL樣品和25 µL 1X Amplite ^TM Red H ₂ O ₂工作溶液。
   

2. 在避光條件下，室溫下孵育反應(yīng)10至30分鐘。
   

3. 使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm處的熒光增加。
   

4. 空白孔（僅使用測(cè)定緩沖液）中的熒光用作對(duì)照，并通過H ₂ O ₂反應(yīng)從那些孔的值中減去。

   11011	Amplite™紅色HRP熒光底物	Amplite™ Red HRP Substrate	1000 Assays
   11012	ReadiUse™TMB底物溶液*適用于ELISA檢測(cè)HRP偶聯(lián)物*	ReadiUse™ TMB Substrate Solution *Optimized for ELISA Assays with HRP Conjugates*	100 ml
   11020	Signal Guard™ HRP反應(yīng)終止液	Signal Guard™ HRP reaction stopping solution	0.5 ml
   11025	ReadiUse™ Preactivated HRP NHS ester	ReadiUse™ Preactivated HRP NHS ester	300 ug