DNA甲基化檢測(cè)（重亞硫酸鹽處理）試劑盒

       DNA甲基化是一種基本的表觀遺傳學(xué)修飾，在基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印跡等方面發(fā)揮重要作用。在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，CpG雙核苷的胞嘧啶第5 位碳原子被選擇性地添加甲基基團(tuán)。 在人類(lèi)腫瘤中，普遍發(fā)生甲基化異常的現(xiàn)象，由于甲基化與胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，因此DNA甲基化狀態(tài)的變化可作為疾病診斷和預(yù)后的一個(gè)有用的指示器。

       最早在1970年，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化就被用于鑒別DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶（5-mC）。現(xiàn)在認(rèn)為在重亞硫酸鹽處理過(guò)程中，5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）都不會(huì)發(fā)生堿基的變化，因此這種方法不能用來(lái)區(qū)別不同的甲基化修飾。在重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化過(guò)程中，DNA首先用重亞硫酸鈉處理，在高溫和低pH條件下，將變性DNA（單鏈DNA）中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胞嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物，這個(gè)反應(yīng)是可逆的；接下來(lái)胞嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物發(fā)生不可逆的水解脫氨基過(guò)程，形成尿嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物。最后在高pH條件下尿嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物脫磺酸基形成尿嘧啶。只有未甲基化的胞嘧啶在重亞硫酸鹽處理下發(fā)生堿基變化， 5-mC和5-hmC仍然保持不變。轉(zhuǎn)化處理后的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，尿嘧啶（U）轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ?span style=";padding: 0px;font-size: 15px;border: 0px;outline: 0px;list-style-type: none;font-style: inherit;vertical-align: middle;text-align: center;line-height: 32px">T）。重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化示意圖如下：

圖1 重亞硫酸鹽處理將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶

       Active motif公司的Bisulfite Conversion Kit提供優(yōu)化的轉(zhuǎn)化試劑、簡(jiǎn)單易用的操作步驟以及陽(yáng)性對(duì)照PCR引物，簡(jiǎn)化了DNA甲基化檢測(cè)的過(guò)程。整個(gè)轉(zhuǎn)化可在1.5小時(shí)之內(nèi)完成，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)99%。試劑盒提供轉(zhuǎn)化特異性PCR引物，可用于測(cè)序前驗(yàn)證重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率。陽(yáng)性對(duì)照PCR引物適用于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理的人和小鼠DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到220 bp的產(chǎn)物。

Active motif同時(shí)也提供MethylDetector™重亞硫酸鹽修飾試劑盒，該試劑盒是Active motif公司最初提供的一款DNA甲基化檢測(cè)試劑盒，原理和Bisulfite Conversion Kit一樣，但轉(zhuǎn)化時(shí)間需要5小時(shí)。

圖2 Bisulfite Conversion Kit 操作流程

使用Bisulfite Conversion Kit，將目的DNA用蛋白酶K處理，加入重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑和DNA變性劑，在溫度循環(huán)儀中進(jìn)行快速熱變性。經(jīng)過(guò)1.5小時(shí)的DNA轉(zhuǎn)化反應(yīng)，樣品加入到試劑盒里的DNA純化柱，脫鹽后洗脫DNA，可用于PCR或其他的下游實(shí)驗(yàn)。

圖3 陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)化特異性PCR引物可用于特異性擴(kuò)增轉(zhuǎn)化后的人和小鼠DNA

使用Bisulfite Conversion Kit處理人（A）和小鼠（B）基因組DNA，處理（Bis）和未處理（Untr）的DNA分別用陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)化特異性PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。陽(yáng)性對(duì)照PCR引物專(zhuān)門(mén)適用于經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA，因此會(huì)擴(kuò)增出220bp的條帶，而未處理的DNA沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。