CRISPR-Cas系統(tǒng)作為原核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其第2類系統(tǒng)（如Cas12、Cas13蛋白）通過向?qū)NA（gRNA）識(shí)別靶標(biāo)核酸后，會(huì)激活非特異性的“反式切割活性”，即對(duì)周圍單鏈核酸（ssDNA或RNA）進(jìn)行無差別切割。這一特性被巧妙轉(zhuǎn)化為分子診斷工具：通過設(shè)計(jì)攜帶熒光淬滅基團(tuán)或顯色基團(tuán)的報(bào)告探針，靶標(biāo)核酸的存在會(huì)觸發(fā)Cas蛋白切割探針，釋放可檢測信號(hào)（如熒光、顏色變化），從而實(shí)現(xiàn)從核酸識(shí)別到信號(hào)轉(zhuǎn)換的高效耦合。 

與傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)（如PCR）相比，基于反式切割活性的檢測方法具有三大核心優(yōu)勢： 

1. 高特異性：gRNA的靶向識(shí)別機(jī)制確保了單堿基錯(cuò)配的分辨能力； 

2. 免復(fù)雜設(shè)備：等溫?cái)U(kuò)增（如LAMP、RPA）與Cas蛋白反應(yīng)可在單一溫度下完成，無需熱循環(huán)儀； 

3. 信號(hào)放大潛力：單個(gè)Cas蛋白分子可切割多個(gè)探針分子，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的指數(shù)級(jí)放大，顯著提升檢測靈敏度（檢測限可達(dá)attomolar級(jí)別）。 

二、CRISPR-Cas技術(shù)與側(cè)向流動(dòng)試紙：可視化POCT的主流平臺(tái)  

側(cè)向流動(dòng)試紙（LFD）因操作簡便、成本低、結(jié)果可視化，成為CRISPR-Cas技術(shù)在POCT中zuichengshu的應(yīng)用形式。其核心原理是將Cas蛋白反應(yīng)與試紙條的層析顯色結(jié)合：靶標(biāo)核酸經(jīng)等溫?cái)U(kuò)增后激活Cas12/13的反式切割活性，切割帶有shengwusu或熒光標(biāo)記的探針，釋放的產(chǎn)物與試紙條上的捕獲探針結(jié)合，形成肉眼可見的條帶。 

1. 關(guān)鍵技術(shù)與代表性系統(tǒng)  

SHERLOCK/DETECTR系統(tǒng)：早期經(jīng)典平臺(tái)，前者利用Cas13檢測RNA，后者利用Cas12檢測DNA，均通過熒光信號(hào)讀取，但需配套儀器。后續(xù)改進(jìn)版本引入側(cè)向流動(dòng)試紙，實(shí)現(xiàn)無儀器肉眼判讀。 

多重檢測技術(shù)：如正交CRISPR-Cas系統(tǒng)（OC-MLFA），通過Cas12a與Cas13a的切割偏好差異，在單條試紙實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)獨(dú)立顯色，避免信號(hào)干擾（如Su等檢測SARS-CoV-2不同變異株）。 

適配體與納米技術(shù)整合：Zhuang等將Cas12a與表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）結(jié)合，在微流控紙基裝置上實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌的超靈敏檢測，檢測限低至10 CFU/mL。 

2. 應(yīng)用領(lǐng)域拓展  

病原體檢測：從病毒（如xinguanbingdu、HPV）到細(xì)菌（如耐jiayangxilinjinhuangseputaoqiujun）、寄生蟲（如瘧原蟲、弓形蟲），覆蓋感染性疾病的快速診斷。例如，Wei等的RPA-Cas12a平臺(tái)通過試紙條直接檢測惡性瘧原蟲，無需核酸提取步驟，15分鐘內(nèi)出結(jié)果。 

非核酸小分子檢測：Jiang等開發(fā)的Bio-SCAN V2系統(tǒng)，利用配體響應(yīng)性crRNA結(jié)合dCas9-shengwusu，將小分子（如chajian）的檢測轉(zhuǎn)化為試紙條顯色，檢測限達(dá)2 μmol/L。 

3. 挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向  

穩(wěn)定性問題：試紙條在高溫高濕環(huán)境下易失效，需優(yōu)化凍干工藝和保存條件（如添加穩(wěn)定劑）。 

多重檢測瓶頸：試紙條空間有限，多靶標(biāo)檢測時(shí)易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，需通過正交Cas蛋白或空間分隔設(shè)計(jì)提升兼容性。 

定量精度不足：肉眼判讀依賴經(jīng)驗(yàn)，需引入智能手機(jī)圖像分析或色度計(jì)實(shí)現(xiàn)半定量。 

三、比色法：基于納米材料的可視化信號(hào)放大  

比色法通過設(shè)計(jì)Cas蛋白切割觸發(fā)納米顆粒（如金納米顆粒AuNPs、氧化石墨烯GO）的聚集或分散，導(dǎo)致溶液顏色變化，實(shí)現(xiàn)肉眼可見的檢測。其核心優(yōu)勢是無需儀器、成本極低，適合資源匱乏地區(qū)。 

1. 核心機(jī)制與納米探針設(shè)計(jì)  

AuNPs聚集顯色：未切割時(shí)，AuNPs表面修飾的DNA探針互補(bǔ)結(jié)合，保持分散（紅色）；Cas蛋白切割后，探針釋放，AuNPs聚集為藍(lán)色，顏色變化與靶標(biāo)濃度正相關(guān)（如Yuan等檢測沙門菌）。 

G-四鏈體/酶催化反應(yīng)：Chen等將Cas12a與G-四鏈體DNA酶結(jié)合，切割后釋放G-四鏈體激活辣根過氧化物酶（HRP），催化底物顯色，檢測副溶血性弧菌的檢測限低至3×10³ CFU/mL。 

2. 多樣化應(yīng)用場景  

病毒與癌癥檢測：Gong等利用鏈置換擴(kuò)增（SDA）聯(lián)合Cas12a，通過AuNPs比色法檢測乙肝病毒DNA，肉眼可分辨10?拷貝/mL；Feng等將Cas12a與滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）結(jié)合，檢測肺癌標(biāo)志物EGFR 19del突變，30分鐘內(nèi)完成。 

食品安全與遺傳?。?/font>Chen等開發(fā)Cas14a介導(dǎo)的比色法檢測黃曲霉毒素B1，結(jié)合磁性納米顆粒分離靶標(biāo)，檢測限達(dá)0.1 ng/mL；Choi等利用AuNP輔助熒光增強(qiáng)，無需擴(kuò)增直接檢測BRCA-1基因突變，30分鐘內(nèi)完成循環(huán)游離DNA分析。 

3. 技術(shù)瓶頸與突破方向  

環(huán)境干擾：光線強(qiáng)度、觀察者主觀差異影響顏色判讀，需建立標(biāo)準(zhǔn)化比色卡或引入智能手機(jī)光譜分析算法（如Xie等的MagicEye軟件）。 

靈敏度限制：依賴納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)，需結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增（如RPA、LAMP）進(jìn)一步提升信號(hào)放大效率。 

四、微流控技術(shù)：集成化與自動(dòng)化的前沿陣地  

微流控芯片通過微米級(jí)通道整合核酸提取、擴(kuò)增、Cas蛋白反應(yīng)及信號(hào)檢測，實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)-結(jié)果出”的全流程自動(dòng)化，是POCT向高通量、多參數(shù)檢測發(fā)展的關(guān)鍵平臺(tái)。 

1. 核心優(yōu)勢與技術(shù)整合  

多步驟一體化：Qin等的微流控芯片集成RT-LAMP擴(kuò)增與Cas13a檢測，5分鐘內(nèi)完成埃博拉病毒RNA檢測，檢測限5.45×10?拷貝/mL，體積僅硬幣大小。 

電化學(xué)與熒光檢測結(jié)合：Najjar等開發(fā)的芯片同時(shí)檢測xinguanbingduRNA（Cas13a熒光信號(hào)）和宿主抗體（ELISA電化學(xué)信號(hào)），通過LAMP預(yù)擴(kuò)增提升靈敏度，適合疫情現(xiàn)場的雙指標(biāo)監(jiān)測。 

2. 代表性應(yīng)用案例  

HIV即時(shí)檢測：Huang等的“差異表達(dá)”芯片利用磁流體驅(qū)動(dòng)樣本轉(zhuǎn)移，避免氣溶膠污染，配套便攜式加熱裝置，結(jié)果可通過手機(jī)APP讀取，檢測窗口期縮短至感染后2周。 

多重耐藥菌檢測：Dai等的單管RPA-Cas12a系統(tǒng)集成到手掌大小反應(yīng)器中，通過便攜式陣列檢測器分析幽門螺桿菌保守基因，15分鐘內(nèi)完成從樣本到結(jié)果的全流程。 

3. 挑戰(zhàn)與未來方向  

成本與量產(chǎn)：芯片制造依賴光刻技術(shù)，單價(jià)較高（約10-20美元/片），需開發(fā)低成本材料（如紙基、PDMS）和簡化工藝流程。 

樣本前處理：復(fù)雜生物樣本（如血清、糞便）需高效純化，需集成微型濾膜或磁珠分離模塊，提升抗干擾能力。 

五、智能手機(jī)與便攜式設(shè)備：構(gòu)建個(gè)性化檢測網(wǎng)絡(luò)  

智能手機(jī)的普及推動(dòng)了POCT的“平民化”，通過攝像頭成像、光譜分析或定制APP，將手機(jī)轉(zhuǎn)化為便攜式檢測儀；而專用設(shè)備（如血糖儀、3D打印可視化器）則進(jìn)一步拓展了檢測場景。 

1.智能手機(jī)輔助檢測  

圖像識(shí)別算法：Zheng等開發(fā)的HPV分型檢測平臺(tái)，設(shè)計(jì)便攜式熒光成像模塊，手機(jī)拍照后通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）分析條帶強(qiáng)度，定量精度達(dá)95%以上。 

化學(xué)發(fā)光與比色結(jié)合：Chen等的G4CLCas平臺(tái)利用手機(jī)成像盒捕獲化學(xué)發(fā)光信號(hào)，檢測核酸和非核酸靶標(biāo)（如心肌肌鈣蛋白I），檢測限低至10?¹² mol/L，適合床旁急診檢測。 

2.專用便攜式設(shè)備  

血糖儀改造：Huang等將Cas12a反應(yīng)與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)，將病毒核酸信號(hào)轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度變化，利用商用血糖儀讀取，實(shí)現(xiàn)xinguanbingdu的定量檢測，檢測范圍10²-10?拷貝/mL。 

3D打印可視化器：Ma等開發(fā)的便攜式裝置結(jié)合CRISPR-Cas12a與上轉(zhuǎn)換熒光粉，非專業(yè)人員可通過手機(jī)APP分析熒光信號(hào)，檢測小分子污染物（如kanameisu），檢測限達(dá)1 pmol/L。 

3.技術(shù)難點(diǎn)與優(yōu)化策略  

硬件標(biāo)準(zhǔn)化：不同手機(jī)攝像頭靈敏度差異導(dǎo)致結(jié)果偏差，需開發(fā)通用型光學(xué)適配器（如濾光片、微距鏡頭）。 

數(shù)據(jù)管理與傳輸：檢測結(jié)果的云端存儲(chǔ)與實(shí)時(shí)共享需解決隱私保護(hù)問題，可引入?yún)^(qū)塊鏈技術(shù)確保數(shù)據(jù)安全。 

六、總結(jié)與展望：從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化之路  

CRISPR-Cas系統(tǒng)憑借反式切割活性，已從基因編輯工具轉(zhuǎn)型為分子診斷的“萬能平臺(tái)”，在POCT中展現(xiàn)出三大核心價(jià)值： 

1. 技術(shù)通用性：同一套Cas蛋白框架可適配核酸、蛋白、小分子等多種靶標(biāo)，僅需更換gRNA和報(bào)告探針； 

2. 場景兼容性：從基層醫(yī)療（如瘧疾快速檢測）到疫情防控（如xinguanbingdu分型）、食品安全（如沙門菌篩查），覆蓋全場景檢測需求； 

3. 成本效益比：單測試劑成本可控制在1-5美元，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)分子診斷（如qPCR約10-30美元）。 

然而，技術(shù)轉(zhuǎn)化仍面臨多重挑戰(zhàn)： 

標(biāo)準(zhǔn)化體系缺失：不同平臺(tái)的檢測限、特異性差異較大，需建立統(tǒng)一的性能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（如WHO體外診斷試劑基準(zhǔn)）； 

非核酸檢測瓶頸：針對(duì)蛋白、代謝物等靶標(biāo)，需開發(fā)高效的信號(hào)轉(zhuǎn)換模塊（如適配體Cas蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)）； 

監(jiān)管與倫理：便攜式設(shè)備的居家使用可能引發(fā)檢測結(jié)果誤判，需配套患者教育體系和遠(yuǎn)程醫(yī)療支持。 

未來發(fā)展方向?qū)⒕劢褂冢?/font> 

1. 多技術(shù)融合：微流控芯片整合CRISPR-Cas與AI圖像分析，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)、高通量檢測； 

2. 材料創(chuàng)新：開發(fā)可降解紙基芯片、凍干型Cas蛋白試劑，提升設(shè)備便攜性和存儲(chǔ)穩(wěn)定性； 

3. 診療一體化：結(jié)合CRISPR的基因編輯功能，構(gòu)建“檢測-干預(yù)”閉環(huán)（如現(xiàn)場檢測耐藥基因后精準(zhǔn)用藥）。 

隨著技術(shù)迭代與監(jiān)管完善，基于CRISPR-Cas的POCT有望成為精準(zhǔn)醫(yī)療的“最后一公里”解決方案，為全球傳染病防控、癌癥早篩和個(gè)性化醫(yī)療提供普惠性技術(shù)支撐。 

相關(guān)產(chǎn)品：RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列