酵母雙雜交(Yeast Two Hybrid, Y2H)可分為核蛋白體系酵母雙雜交和膜蛋白體系酵母雙雜交，兩種體系大致原理相同。以下為大家分別介紹：
 

　　1、核體系酵母雙雜交技術(shù)原理
 

　　核蛋白酵母雙雜交主要原理是基于酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4由兩個(gè)可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。其中N端的147個(gè)氨基酸組成GAL的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, BD)，負(fù)責(zé)與基因上游的激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合；C端的113個(gè)氨基酸組成GAL的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription activation domain,AD)，負(fù)責(zé)激活UAS下游的基因轉(zhuǎn)錄過程。BD與AD在單獨(dú)存在時(shí)無法激活UAS下游基因轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)BD與AD在空間上接近時(shí)才能發(fā)揮完整的轉(zhuǎn)錄因子功能，激活UAS下游基因的表達(dá)，使得菌落能夠在缺陷培養(yǎng)基中的生長情況或者通過顯色反應(yīng)進(jìn)行顯色。例如當(dāng)報(bào)告基因?yàn)長acZ時(shí)，在培養(yǎng)基中加入顯色底物X-Gal，當(dāng)BD與AD同時(shí)存在時(shí)，LacZ正常表達(dá)，生成β-半乳糖苷酶，將X-Gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4氯靛藍(lán)，使得菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。
 

圖 酵母GAL4轉(zhuǎn)錄激活示意圖
 

　　在進(jìn)行酵母雙雜實(shí)驗(yàn)時(shí)，將已知的誘餌蛋白X與BD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)；捕獲蛋白Y與AD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)。若蛋白A和蛋白B存在互作，則BD和AD在空間上會(huì)靠近，成為有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游報(bào)告基因表達(dá)；若蛋白A和蛋白B不存在互作，則BD和AD在空間上較遠(yuǎn)，單獨(dú)無法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，報(bào)告基因不表達(dá)。酵母文庫構(gòu)建和篩選則是將捕獲蛋白更換為蛋白文庫，構(gòu)建融合表達(dá)AD結(jié)構(gòu)域的文庫質(zhì)粒，并形成酵母文庫，從而利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與誘餌蛋白A存在相互作用的未知蛋白。
 

圖酵母雙雜交原理示意圖
 

　　2、膜體系酵母雙雜交技術(shù)原理
 

　　膜蛋白酵母雙雜交主要原理是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導(dǎo)的DUAL membrane系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要利用泛素(Ubiquitin,Ub)作為26S蛋白酶體降解蛋白標(biāo)簽的特性，可分為N端(1-37個(gè)氨基酸NubI結(jié)構(gòu)域，通常將第13位liangansuan突變?yōu)間anansuan或者binansuan(NubG)以降低與Cub的自重組)和C端(35-76個(gè)氨基酸Cub結(jié)構(gòu)域)，當(dāng)NubG和Cub相互靠近時(shí)，能夠發(fā)揮標(biāo)簽功能，通過泛素修飾目標(biāo)蛋白，使目標(biāo)蛋白被泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑識(shí)別并剪切?；谠撛?，將Cub末端添加轉(zhuǎn)錄因子形成Cub-TF，在NubG與Cub-TF靠近后，可以將TF剪掉并進(jìn)入細(xì)胞核，激活報(bào)道基因表達(dá)。
 

　　在進(jìn)行膜體系酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，將誘餌蛋白X和獵物蛋白Y分別構(gòu)建到Cub-TF載體和NubG載體，如果X和Y存在相互作用，則Cub-TF和NubG相互靠近，將TF進(jìn)行泛素標(biāo)記并被泛素特異性蛋白酶UBPs識(shí)別剪切后釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，激活報(bào)告基因表達(dá)。
 

圖 膜蛋白酵母雙雜交原理示意圖
 

　　技術(shù)優(yōu)勢
 

　　基于報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物累積效應(yīng)，檢測靈敏度高；
 

　　以報(bào)告基因?yàn)闄z測對(duì)象，可用于檢測弱蛋白相互作用或者瞬時(shí)相互作用；
 

　　無需抗體或者蛋白純化操作；
 

　　相對(duì)其他方法，成本較低；
 

　　技術(shù)缺陷
 

　　由于部分基因具有自激活效應(yīng)，因此可能存在假陽性；
 

　　一定程度可以模擬生理互作，但與哺乳細(xì)胞仍有一定區(qū)別；
 

　　外源蛋白可能對(duì)酵母具有毒性，抑制酵母生長，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
 

　　Y2H技術(shù)流程
 

　　1、酵母感受態(tài)細(xì)胞制備
 

　　PS：經(jīng)費(fèi)充足的小伙伴可以直接購買商用感受態(tài)細(xì)胞，省時(shí)省力，經(jīng)費(fèi)稍顯緊張的小伙伴就只能按照以下步驟付出人力成本啦。
 

　　(1)取- 80℃保存的酵母菌株涂布到Y(jié)PDA培養(yǎng)基平板，28℃倒置培養(yǎng)4-7 d；
 

　　(2)挑取單克隆菌落加入到10 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃，250 rpm條件下震蕩培養(yǎng)至OD600 = 1.4-1.8，并逐步擴(kuò)大培養(yǎng)至50-100 mL；
 

　　(3)待菌株生長至合適密度時(shí)(OD600 = 0.6-0.8)，收集菌液，1000 g轉(zhuǎn)速下室溫離心5 min，收集細(xì)胞沉淀；
 

　　(5)加入50 mL無菌超純水(或者生理鹽水)重懸酵母細(xì)胞進(jìn)行洗滌；
 

　　(6)1000 g轉(zhuǎn)速下室溫離心5 min，收集細(xì)胞沉淀；
 

　　(7)加入3 mL 1.1 × TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞進(jìn)行洗滌；
 

　　(8)重懸的酵母細(xì)胞等體積轉(zhuǎn)移至新的離心管，6000 g轉(zhuǎn)速下室溫離心30 s；
 

　　(9)收集沉淀并加入適量1.1 × TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，分裝至100 μL/管，-80℃保存?zhèn)溆谩?br /> 

　　2、酵母轉(zhuǎn)化
 

　　(1)取出酵母感受態(tài)細(xì)胞，分別加入10 μL ssDNA，0.1 μg質(zhì)粒，PEG/LiAc 600 μL，渦旋混勻。(PS: ssDNA作用類似于鮭魚精DNA，避免質(zhì)粒在轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中被降解。）
 

　　(2)30℃水浴30 min，加入70 μL DMSO；
 

　　(3)42℃熱激15 min，冰上冷卻2 min；
 

　　(4)2000 g轉(zhuǎn)速下室溫離心10 s，棄上清；
 

　　(5)加入1 mL無菌水(或者生理鹽水)重懸沉淀；
 

　　(6)吸取200 μL轉(zhuǎn)化混合物涂布到營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)平板中；
 

　　(7)28℃倒置培養(yǎng)2-4 d，觀察菌落生長情況。
 

圖 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)流程示意圖(圖片來源于網(wǎng)絡(luò))
 

　　由于酵母雙雜交系統(tǒng)可能存在自激活現(xiàn)象(與BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合的誘餌蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，在BD結(jié)合UAS序列后無需AD結(jié)構(gòu)域即可激活下游報(bào)告基因表達(dá)；或者與BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合的誘餌蛋白與酵母內(nèi)源具有轉(zhuǎn)錄激活活性的蛋白互作，激活下游報(bào)告基因表達(dá))。為保證酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠性，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)通常設(shè)置陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組、自激活組以及實(shí)驗(yàn)組等(以核體系酵母雙雜交為例)。
 

　　陰性對(duì)照組：pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT；
 

　　陽性對(duì)照組：pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT；
 

　　自激活組：pGBKT7-X + pGADT7；
 

　　實(shí)驗(yàn)組：pGBKT7-X + pGADT7-Y；
 

　　對(duì)照組(可選)：pGBKT7 + pGADT7；pGBKT7 + pGADT7-Y；
 

　　酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)通常使用SD/ -Trp/ -Leu二缺培養(yǎng)板，用于驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效果；SD/ -Trp/ -Leu/ -His三缺培養(yǎng)板，用于驗(yàn)證是否存在自激活；SD/ -Trp/ -Leu/- His/ -Ade為四缺培養(yǎng)板，用于主要驗(yàn)證互作結(jié)果。
 

酵母雙雜交結(jié)果示意圖(圖片參考網(wǎng)絡(luò)繪制)
 

　　如上圖所示，在二缺板中，所有分組均有菌落，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。
 

　　pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT組為陰性對(duì)照，由于Lam和ADT不存在互作，無法激活下游報(bào)告基因表達(dá)，因此在三缺板和四缺板中均未出現(xiàn)菌落；
 

　　pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT組為陽性對(duì)照，由于P53與ADT存在互作，BD和AD靠近，激活下游報(bào)告基因表達(dá)，因此在三缺和四缺板中長出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7為自激活組，若蛋白X沒有轉(zhuǎn)錄激活活性或者不存在具有轉(zhuǎn)錄激活活性的酵母內(nèi)源蛋白與X互作，則三缺板和四缺板中無法長出菌落；若存在自激活現(xiàn)象，則在三缺板和四缺板中長出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7-Y為實(shí)驗(yàn)組，由于蛋白X和蛋白Y存在相互作用，因此能夠激活下游報(bào)告基因表達(dá)，可在三缺和四缺板中長出菌落。
 

　　PS：如果在培養(yǎng)板中加入X-gal，則在進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，陽性菌落因表達(dá)報(bào)告基因LacZ，將X-gal切割將成半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4氯靛藍(lán)，使得菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；這也是為什么有些文章酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)菌落顏色為藍(lán)色。
 

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