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南京沃博生物科技有限公司

膠原誘導小鼠關節(jié)炎方案(CIA)

時間:2023-4-25閱讀:1730

膠原誘發(fā)的關節(jié)炎與人類風濕病關節(jié)炎具有共同的免疫學和病理學特征,因此CIA模型被廣泛應用于研究致病機理及治療方法的研究。盡管關節(jié)炎模型是可復制的,但要成功誘導高發(fā)病率和嚴重程度的關節(jié)炎,一些影響造模因素需要考慮。

以下是成功誘發(fā)小鼠關節(jié)炎的一些重要因素。在造模之前,特別是對于shouci造模者,這些因素需要提前考慮到。然而,正如其它生物模型,不同研究單位的方案有所不同,因此,每個研究者需要確定自己的研究方案。

動物管理與飼養(yǎng)

       動物必須是7-8 周齡健康的并在SPF條件下飼養(yǎng)的動物。一般來說,對于腸道菌群,不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應答。濾過性毒菌和細菌感染也會影響機體對膠原的免疫應答及關節(jié)炎進展。例如:感染肝炎病毒(MHV)的小鼠,不能夠誘發(fā)關節(jié)炎。飲食也會影響關節(jié)炎的發(fā)病率和嚴重程度,CIA在飼喂不同飲食的小鼠中差異很大。飼喂高脂肪的食物更容易引起高發(fā)病率和嚴重關節(jié)炎。

小鼠品系

      小鼠對CIA的易感性與MHC-Ⅱ類分子相關,同時也取決于接種二型膠原的小鼠品系。有兩個小鼠品系被廣泛應用,因為這兩個品系對CIA高度易感。一個是DBA/(H-2q)小鼠,對雞 牛 豬和人二型膠原有免疫應答,另一個品系B10.RⅢ(H-2r)小鼠,對牛和豬的二型膠原有免疫應答,對雞和人二型膠原有較弱的免疫應答。兩個品系對小鼠的二型膠原都有較弱的免疫應答,小鼠二型膠原的抗體水平低于關節(jié)炎抗體水平的1%。因此,如果用小鼠的二型膠原免疫小鼠的話,關節(jié)炎發(fā)生率約為10%。列表為用于CIA及CAIA 動物模型研究的小鼠品系.

另一方面,CIA抗性的小鼠不總是不產(chǎn)生關節(jié)炎抗體。最近研究表明,對CIA的敏感性不僅取決于MHC 類型,同時CIA抗性的小鼠C57BL/6, 129/Sv(H-2b), and Balb/c (H-2d) ,當INF-r 和IL-10 基因敲除后,小鼠能產(chǎn)生針對的關節(jié)炎自身抗體。這表明,對關節(jié)炎的敏感性也取決于不同細胞因子水平。

佐劑

     wanquan佐劑對于誘發(fā)小鼠關節(jié)炎是很重要的。不同于大鼠,用二型膠原加IFA免疫小鼠,不產(chǎn)生關節(jié)炎??贵w產(chǎn)生,包括IgG2a抗體對于激活補體及隨后的關節(jié)炎的發(fā)生具有重要作用,取決于wanquan佐劑中結核桿菌的含量。最近,Campbell 用CFA(5mg/ml)在對CIA抗性的小鼠中成功誘發(fā)高發(fā)病率的關節(jié)炎(50-70%),例如:C57BL/6, B10, and129/Sv mice (H-2b). ,wanquan佐劑濃度(結核桿菌含量)取決于各研究單位動物管理委員會推薦。

目錄號

產(chǎn)品名稱

7002

Incomplete  Freund’s Adjuvant,5ml

7008

Complete  Freund’s Adjuvant,5mlx1mg/ml

7009

Complete  Freund’s Adjuvant,5mlx2mg/ml

7015

Complete  Freund’s Adjuvant,5mlx3mg/ml

7001

Complete  Freund’s Adjuvant,5mlx4mg/ml

7023

Complete  Freund’s Adjuvant,5mlx5mg/ml

7027

Complete  Freund’s Adjuvant,5mlx10mg/ml

7024

Complete  Freund’s Adjuvant,5mlx20mg/ml

膠原

      因為去糖基化的膠原會影響關節(jié)炎的產(chǎn)生,同時一些未去除的雜質比如:weidanbaimei可能會導致T細胞刺激試驗中產(chǎn)生假陽性,因此Ⅱ型膠原應按規(guī)定高度純化。如果按恰當?shù)姆椒▋龈傻哪z原-20℃避光保存的條件下,是非常穩(wěn)定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸中,終濃度為2-4mg/mL,溫和攪拌,4℃過夜。膠原溶液在4℃保存一周,此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別的Ⅱ型膠原。(見表1) 

表1 不同種屬來源Ⅱ型膠原

Catalog#

Description

20011 

雞Ⅱ型膠原,10mg

20012

雞2型膠原, 5 ml x 2  mg/ml

20021.

牛2型膠原, 10 mg

20022

牛2型膠原, 5 ml x 2  mg/ml

20031

豬2型膠原, 10 mg

20032

 豬2型膠原, 5 ml x 2  mg/ml

20041

大鼠2型膠原, 5 mg

20042

大鼠2型膠原,2.5 ml x 2  mg/ml

20051

人2型膠原, 1 mg

20052

人2型膠原, 0.5 ml x 2  mg/ml

20061

小鼠2型膠原, 1 mg

20062

小鼠2型膠原, 0.5 ml x 2  mg/ml

乳劑的制備

1)乳劑的質量對于誘發(fā)關節(jié)炎有至關重要的重要。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導致乳劑不能夠有效的、穩(wěn)定的誘發(fā)關節(jié)炎。此外,超聲波處理方法,至少將膠原分成2個片段,這些小片段在正常體溫下,很容易變性。推薦使用電動的高速攪拌器:

用高速攪拌器(帶直徑≤5mm的刀片,F(xiàn)ig.1)攪拌不wanquan佐劑(IFA)和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端,可以把5mL或10mL的注射器從活塞處剪去一半(Fig.2b)。把注射器夾緊,固定在鐵架臺上,并冰浴。最后一步很重要,因在攪拌過程中會發(fā)熱,會引起蛋白變性,變性的蛋白不能夠誘發(fā)關節(jié)炎(CIA)。


 

 

Fig1. 高速攪拌器Fig2 刀片,截斷的注射器,漢密爾頓玻璃注射器

 

Fig. 截斷的注射器,支架上固定,冰浴


2)加1體積(最多2.5mL)wanquan佐劑(不wanquan佐劑在加強免疫時用到)到注射器,再加等體積的膠原溶液(0.05M醋酸溶解的的膠原溶液,終濃度2mg/mL),邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。

3)繼續(xù)混合,直到在最大轉速產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液(轉速約30000rpm/2-3 min)。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對于大體積(2-5Ml)為了使乳液混合均勻,建議在混勻過程中移動攪拌位置。

注:可能需重復攪拌2-3次

4)將一滴乳劑滴與一燒杯水中,檢測乳劑的穩(wěn)定性。如果乳劑是穩(wěn)定的,在水中是成團的,不散開。

 注:如果乳劑在水面散開,表明乳劑不穩(wěn)定。再加幾滴佐劑,重新混合后,再檢測。

5)將乳劑轉移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器,因為很難做到一個準確的注射劑量。

注1:通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器(活塞部向下)。否則很難做到一個精確的注射劑量。

注2:建議在乳劑制備好的一小時內,注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。

免疫部位

      在鼠尾根部注射0.1mL(膠原:100μg)乳劑(Fig.4)。例如:從尾根部50px處插入針頭,直到針尖插入位置距尾根部12.5px。針插入皮下且每次注射充分擦拭,防止乳液的露出。針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入。如果要加強免疫,注射部位在尾根部3Cm處,針尖插入皮下?lián)笪哺?7.5px處。

注1:背部皮下注射也非常有效,但需注射更多的膠原乳劑(0.5-1Ml)。

注2:無論如何,我們不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑,如初次免疫或加強免疫。因為不wanquan佐劑在腹膜和腹腔引起嚴重的炎癥反應。

免疫程序

Ⅱ型膠原的自身IgG抗體水平及其亞型(可激活補體),對關節(jié)炎的發(fā)生很重要。依據(jù)實驗目的有很多種方法可誘發(fā)高發(fā)病率的關節(jié)炎。

a.      通過單次免疫(無加強免疫)誘發(fā)關節(jié)炎

依據(jù)說明書方法制備乳劑-膠原-wanquan佐劑(4mg/ml)和免疫,對于一些易感品系如DBA/(H-2q)和B10.RⅢ(H-2r),將會在3.5-4周引發(fā)關節(jié)炎,6-8周發(fā)病率達90-100%。關節(jié)炎嚴重程度,臨床評分可達到10-12分(最高16分)。

注:由于高濃度的結核桿菌,一般免疫部位的炎癥程度會很高。因此,可選用b 或C 方案。 

b 通過加強免疫誘發(fā)關節(jié)炎

按上述方法制備乳劑和免疫,初次免疫CFA(1mg/ml)。7天或21天后用膠原和不wanquan佐劑加強免疫。尾部皮下注射0.05-0.1ml乳劑,避開初次免疫部位,多點注射。初次免疫后4-4.5周后發(fā)病。6-8周發(fā)病率在80-100%,臨床評分可達8-12分(最高16分),比方案A關節(jié)炎程度少輕。

C通過LPS加強免疫

LPS和體內二型膠原自身抗體水平對于誘發(fā)關節(jié)炎具有協(xié)同效應。此外,經(jīng)典的CIA ,免疫LPS(B細胞分裂素)或MAM(支原體產(chǎn)生的T細胞分裂素)或SEB(jinghuangseputaoqiujun產(chǎn)生的T細胞分裂素)后,都會加強關節(jié)炎程度。因此這些毒素不僅用于引發(fā)和加強關節(jié)炎水平而且用于zhiding關節(jié)炎發(fā)生時間。。

按方案B,免疫二型膠原和CFA 乳劑。25-28天或在在關節(jié)炎想發(fā)生的3-5天前腹腔注射LPS(25-50ug)。關節(jié)炎將在24-48小時發(fā)生,發(fā)病率90-100%。

D 用高劑量的CFA加強免疫

    對于一些CIA抗性的小鼠,例如:B10 (H-2b), C57BL/6 (H-2b),and C57BL/6x129/Sv (H-2b) ,以下方案。按上述方案制備膠原和佐劑(5mg/ml),尾部注射0.1ml。然而,有必要用高濃度的CFA 加強免疫。21天后,加強免疫,制備膠原和佐劑(5mg/ml),尾部注射0.1ml。4-6周發(fā)病,6-7周發(fā)病率在50-70%。

臨床評分

關節(jié)炎可通過臨床評分來定性評估或用測厚儀來測量爪子厚度來評估。這些方法適用于所有的關節(jié)炎模型比如經(jīng)典的CIA,佐劑誘導的關節(jié)炎和棉線誘導的關節(jié)炎。

表2  關節(jié)炎炎癥程度的臨床評分

得分

發(fā)病情況

0

正常

1

輕度的、踝關節(jié)、腕關節(jié)發(fā)紅、腫脹

2

踝關節(jié)或腕關節(jié)中度發(fā)紅腫脹

3

爪子嚴重發(fā)紅、腫脹,包括指端

4

四肢zuidachengdu發(fā)炎,包括多關節(jié)。


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