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NAD激酶(NADK)試劑盒,微板法

NAD激酶(NADK)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 NAD 激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS4580W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn) 的生物體內(nèi)惟一能夠催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，因此，NAD 激酶在合成 NADP(H) 以及調(diào)節(jié) NAD(H)與 NADP(H)的平衡上具有重要作用。 NADK 催化 NAD+磷酸化生成 NADP+；接著在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶和 6-磷酸葡萄糖作 用下，使 NADP+還原成 NADPH。通過檢測 NADPH 在 340 nm 下的增加速率?？傻贸?NADK 酶活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水溶 解。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水溶 解。 試劑三 液體 16mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水溶 解。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、蒸餾水。 四、NAD 激酶（NADK）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。4℃×12000g 離心 10min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液； 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，300W，超聲 3s，間隔 7s，重復(fù) 30 次）； 4℃×12000g 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本：直接檢測，若渾濁則離心后取上清液檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃） ③ 在 96 孔板中依次加入下列試劑：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 160 混勻，25℃下孵育 5-10min 試劑四 10 混勻，25℃下立即于 340nm 處讀取 A1，2min 后讀 取 A2，△A=A2-A1。 【注】1. 若 A2 值大于 1.5，則可減少樣本上樣量 V1（如減至 5μL，則試劑三相應(yīng)增加），或縮短 反應(yīng)時(shí)間 T（如縮至 1min 或更短），則改變后的加樣量 V1 和反應(yīng)時(shí)間 T 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若△A 在零附近徘徊，可增加樣本量（如增至 20μL，則試劑三相應(yīng)減少），或增加反應(yīng)時(shí) 間 T（如增至 5min 或更長）。則改變后的加樣量 V1 和反應(yīng)時(shí)間 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1μmol 的 NADP+定義為一個(gè)酶活力單位。 NADK（μmol/min/mg prot）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷(V1×Cpr) ÷T=3.22×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘生成 1μmol 的 NADP+定義為一個(gè)酶活力單位。 NADK（μmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷(W× V1÷V) ÷T=3.22×ΔA÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1μmol 的 NADP+定義為一個(gè)酶活力單位。 NADK（μmol/min /104 cell）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷(500×V1÷V) ÷T=0.006×ΔA 4、按液體樣本計(jì)算: 酶活定義：每毫升液體每分鐘生成 1μmol 的 NADP+定義為一個(gè)酶活力單位。 NADK（μmol/min/mL）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷V1÷T=3.22×ΔA ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； T---反應(yīng)時(shí)間，2 min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。