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中性木聚糖酶測(cè)定試劑盒,微板法

中性木聚糖酶測(cè)定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）測(cè)定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS0170W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 木聚糖酶在自然界分布廣泛，可從動(dòng)物、植物和微生物中獲得?？蓪⒛揪厶墙到獬傻?聚糖和木糖的一組酶的總稱，也被稱為戊聚糖酶或半纖維素酶，廣泛應(yīng)用于釀造和飼料 工業(yè)中。 中性木聚糖酶（NEX）在中性環(huán)境中水解木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水 浴條件下進(jìn)一步與 3,5-二硝基水楊中發(fā)生顯色反應(yīng)，在 540nm 處有特征吸收峰，反應(yīng) 液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，通過測(cè)定反應(yīng)液在 540nm 吸光值增加速 率，可計(jì)算 NEX 活力。 二、試劑盒組分與配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 100mL 液體×1 瓶 4℃保存 試劑一 25mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 再加 12.5mL 試劑一溶解備用。 試劑三 21mL×1 瓶 -20℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、中性木聚糖酶（NEX）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、 樣本制備： 1 組織樣本：稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙 醇冰浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中 加入經(jīng)預(yù)冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清， 留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm， 4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。 ② 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè))：提取液體積(mL)為 500：1 的比例進(jìn)行提取。 3 液體樣本：澄清液體直接檢測(cè)；若渾濁則 12000rpm，4℃，離心 15min，取上清待測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm。在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 50 50 試劑一 50 50 試劑二 50 40℃孵育60min 試劑二 50 試劑三 100 100本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，沸水?。?/span>95-100℃）5min，冷卻至室溫 蒸餾水 100 100 混勻，取出200μL待檢液至96孔板中，于540nm處讀取吸 光值A，ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】1. 若 A 值大于 1.5，最后一步檢測(cè)時(shí)可進(jìn)行稀釋：如取 100μL 待檢液至 96 孔板中，再加 100μL 蒸餾水，相當(dāng)于稀釋倍數(shù) D 為 2，需帶入計(jì)算公式參與計(jì)算。 2. 若ΔA 小于 0.01，則可增加樣本加樣體積 V1（如增至 100μL，則試劑一減少為 0μL）， 則改變后的 V1 代入公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 2.3432x - 0.0246，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（μmol），y 是△A。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：40℃，PH6.0 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生 1nmol 木糖所需的 酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。 NEX 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷Cpr×D 3、按鮮重計(jì)算： 酶活定義：40℃，PH6.0 條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生 1nmol 還原糖所需的 酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。 NEX 活力(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(W×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷W×D 4、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：40℃，PH6.0 條件下，每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生 1nmol 還 原糖所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。 NEX 活力(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(500×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷500×D 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：40℃，PH6.0 條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生 1nmol 木糖 所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。 NEX 活力(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷V1÷T×D=142.3×(ΔA+0.0246)×D V--提取液體積，1mL； V1--樣本體積，0.05mL； T--反應(yīng)時(shí)間，60min； W--樣本質(zhì)量，g； 木糖分子量--150.131；500--細(xì)胞數(shù)量，萬；D--稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4,0.6,0.8, 1. mg/mL。 3 50μL 標(biāo)準(zhǔn)品+50μL 試劑一+50μL 蒸餾水+100μL 試劑三，混勻，沸水浴（95-100℃） 5min，冷卻至室溫，再加 100μL 蒸餾水，混勻后取出 200μL 液體至 96 孔板中，于 540nm 處讀取吸光值 A。根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。