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糖化酶/葡萄糖淀fen酶試劑盒,微板法

糖化酶/葡萄糖淀fen酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 糖化酶(Glucoamylase)試劑盒說明書 （貨號：WS9650W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 糖化酶，又稱葡萄糖*粉酶（EC 3.2.1.3），是一種外切型糖苷酶，它從淀粉的非還原性 末端水解α-1,4 糖苷鍵和α-1,6 糖苷鍵，將淀粉*全水解為葡萄糖，因此廣泛的應(yīng)用于酒精、 白酒、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸，甘油，淀粉糖等工業(yè)中，是我國重要的工業(yè)酶制劑之一。 糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，與 3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色化合物，在 540nm 處有光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與葡萄糖的量成正比，可測定計算得糖化 酶的活力。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前用提取液于 80℃水浴溶 解，并定容至 10mL。 試劑二 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、糖化酶活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細(xì)胞（冰浴，功率 20%或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm。 ② 所有試劑解凍至室溫； ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10本試劑盒僅供科研使用 2 煮沸樣本 10 試劑一 100 100 充分混勻，40℃反應(yīng) 20min 試劑二 200 200 混勻，沸水?。?/span>95-100℃）5min，流水冷卻后，取出 200μL 至 96 孔板中，于 540nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測定-A 對照（每個樣本自身需做一個自身對照）。 【注】：1. 若ΔA 過小，可以延長 40℃反應(yīng)時間 T（如：40min 或更長），或增加樣本量 V1（如增至 20μL，則試劑二相應(yīng)減?。?，重新調(diào)整的反應(yīng)時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 2. 若 A 值大于 1.5，可縮減 40℃反應(yīng)時間 T（如：10min 或更短），或減少樣本量 V1（如減 至 5μL，則試劑二相應(yīng)增加），重新調(diào)整的反應(yīng)時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0239x-0.0515，x 是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 定義：每毫克組織蛋白每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1μg 葡萄糖所需酶量為一個酶活單位。 糖化酶活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷ (V1×Cpr) ÷T=209.21×(ΔA+0.0515)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每克組織每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1μg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。 糖化酶活性(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷(W×V1÷V) ÷T=209.21×(ΔA+0.0515)÷W 4、按細(xì)胞數(shù)量計算： 定義：每 104個細(xì)胞每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1μg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。 糖化酶活性(nmol /min /104 cell)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷(500×V1÷V)÷T=0.419×(△A+0.0515) 5、按照液體體積計算： 定義：每毫升液體每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生 1μg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。 糖化酶活性(nmol /min /104 cell)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷V1÷T=209.21×(ΔA+0.0515) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時間，20min； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 1, 2, 3, 4, 5 mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測定管加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。