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谷an酰胺酶(GLS)試劑盒,微板法

谷an酰胺酶(GLS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 谷*酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書 (貨號(hào)：WS7040W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 谷*酰胺酶（GLS，EC 3.5.1.2）是酰胺酶的一種，催化谷*酰胺水解成谷*酸和氨， 在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。 谷*酰胺酶（GLS）催化谷*酰胺水解成 L-谷*酸和氨，利用氨在強(qiáng)堿的環(huán)境下與次 氯酸鹽和*酚作用，生成水溶性染料靛酚藍(lán)，溶液顏色穩(wěn)定。其在 630nm 處有特征吸收 峰，通過檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算該酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，每瓶再加 11mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 3.5mL×4 瓶 B：液體μL×1 支 4℃保存 臨用前取 30μL 的 B 液進(jìn)一瓶 A 液中，混勻后作 為試劑六使用?；靹蚝蟮脑噭┝恢軆?nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)管 液體 mL×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該標(biāo)曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸餾水。 四、谷*酰胺酶（GLS）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分足的樣本可取 0.2-0.5g），加入 1mL 提取液；進(jìn)行 冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s， 重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 630nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 40 40 試劑一 100 100 試劑二 100 試劑三 100 混勻，放入 37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中孵育 1h本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 100 試劑三 100 混勻，室溫 12000rpm 離心 10min，上清液待測(cè)。 ③ 顯色反應(yīng)：在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 上清液（上步反應(yīng)） 30 30 蒸餾水 30 30 試劑四 60 60 試劑五 30 30 試劑六 60 60 充分混勻，37℃放置 20min 后，于 630nm 處讀取吸光值 A， ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】1. 試劑四和五和六需分開加，不能事先混勻。 2. 若ΔA 的值較小，可增加 37℃孵育時(shí)間（如增至 2 小時(shí)或更長(zhǎng)），或在顯色階段增加上清液量 V1(如增至 60μL，則蒸餾水體積相應(yīng)減少)；則改變后的 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若 A 測(cè)定大于 1.5，可減少 37℃孵育時(shí)間（如減至 0.5 小時(shí)或更短），或在顯色階段減少上清 液量 V1(如減至 15μL，則蒸餾水體積相應(yīng)增加)；則改變后的 T 和 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 3.229x - 0.0118；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克蛋白質(zhì)每小時(shí)催化谷*酰胺生成 1μg 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 GLS(μg/h/mg prot)=(ΔA+0.0118)÷3.229×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=87.75×(ΔA+0.0118)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每小時(shí)催化谷*酰胺生成 1μg 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 GLS(μg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.0118)÷3.229×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T=87.75×(ΔA+0.0118)÷W 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)催化谷*酰胺生成 1μg 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 GLS(μg/h/104 cell)=(ΔA+0.0118)÷3.229×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.18×(ΔA+0.0118) 5、按照液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每小時(shí)催化谷*酰胺生成 1μg 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 GLS(μg/h/mL)=(ΔA+0.0118)÷3.229×(V2÷V3)÷V1÷T=87.75×(ΔA+0.0118) V---提取液體積，1mL； V1---加入②歩反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL； V2---②歩反應(yīng)體系總體積：0.34mL； V3---③歩顯色步驟中上清液體積，0.03mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1h； W---樣本質(zhì)量； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μg/mL 氨），把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。 2 按照顯色反應(yīng)階段的測(cè)定管加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。