上海宇淳生物科技有限公司
主營產(chǎn)品: PCR八聯(lián)排管,sigma現(xiàn)貨,Cy7試劑 |
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參考價(jià) | ¥520-¥880 |
-
型號(hào)
-
品牌
其他品牌 -
廠商性質(zhì)
經(jīng)銷商 -
所在地
上海市
48T | 520元 | 1 盒 可售 |
96T | 880元 | 1 盒 可售 |
更新時(shí)間:2024-06-03 11:08:45瀏覽次數(shù):258
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硝酸還原酶(NR)試劑盒,微板法
硝酸還原酶(NR)試劑盒,微板法
本試劑盒僅供科研使用 1 硝酸還原酶(Nitrate Reductase,NR)活性測定試劑盒說明書 (貨號(hào):WS2040W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡介: 硝酸還原酶(NR,EC 1.7.1.3)廣泛存在于植物中,是一種誘導(dǎo)酶。是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn) 化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶,與作物有效吸收和利用氮素肥料有關(guān),是植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的 指標(biāo)之一,也可作為品種選育的指標(biāo)之一。 本試劑盒采用離體法檢測,通過硝酸還原酶催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,亞硝酸鹽進(jìn) 一步與磺胺及α-萘胺定量生成紫紅色偶氮化合物;顏色深淺與硝酸還原酶活性呈正比, 通過檢測該物質(zhì)于 530nm 的吸光值,即可得出硝酸還原酶的活性。 二、試劑盒的組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入試管底部,再加 10mL 提取液溶解,仍 4℃保存。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部,每支分別 加 1mL 蒸餾水溶解,用不完的試劑分裝后-20℃ 保存,禁止反復(fù)凍融,三天內(nèi)用完。 試劑三 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,每瓶再加 6mL 蒸 餾水,于 70℃水浴約半小時(shí)至*全溶解備用。 試劑四 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 使用前需超聲至*全溶解。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲,則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、研缽、冰和蒸餾水。 四、硝酸還原酶(NR)活性測定: 由于硝酸還原酶是個(gè)誘導(dǎo)酶,酶活性大小與取樣前是否誘導(dǎo)有關(guān)(施過氮肥、光照充足 條件下所取植物樣本即為誘導(dǎo)處理樣本),因此務(wù)必取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定,依據(jù)預(yù)測定結(jié)果選 擇是否進(jìn)行誘導(dǎo)處理。 酶的誘導(dǎo)(選做):取適量新鮮樣本洗凈,放入盛有 1mg/mL 硝酸鉀溶液(自備)的 燒杯中(淹沒即可),浸泡 2h,取出樣本用濾紙吸干后,-20℃冷凍 30min,取出樣本再 用濾紙吸干后即可按照樣本制備步驟制備待測上清液。 1、樣本制備: ① 組織樣本:稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿(難磨樣本可用石英砂 研磨,不能用液氮研磨)。12000rpm,4℃離心 10min,取上清液,置冰上待測。 【注意】提取過程操作應(yīng)迅速,并且在 4℃下進(jìn)行。若樣本顏色較深(如植物葉片),可在樣本制備過 程中增加除色素步驟:取約 0.2g 組織(水分充足的樣本可取 1g),加入 1mL 的 80%乙醇冰浴勻漿, 12000rpm,4℃離心 10min,棄掉色素較深的上清液;以上除色素步驟重復(fù) 2 次。最后向離心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液,混勻或再次冰浴勻漿,12000rpm,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液; 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,300W,超聲 3s,間隔 7s,總時(shí)間 3min);12000rpm, 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 2、上機(jī)檢測: ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 530nm。 ② 反應(yīng) mix 的制備:已*全溶解的試劑三和試劑四按照 1:1 的比例混合(每次可根據(jù)本試劑盒僅供科研使用 2 檢測樣本數(shù)量現(xiàn)用現(xiàn)配),試劑三和四*全溶解后于 4℃存放一段時(shí)間會(huì)有沉淀析 出,每次配置反應(yīng) mix 前需重新*全溶解。 ③ 在 96 孔板中依次加入: 試劑名稱(μL) 測定管 對(duì)照管 樣本 20 20 試劑一 70 試劑二 30 蒸餾水 100 30℃(如水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱)避光培養(yǎng) 30min 反應(yīng) mix 100 100 混勻,30℃避光反應(yīng) 15min,立即于 530nm 處讀取吸光值 A, △A=A 測定-A 對(duì)照(每個(gè)樣本需做一個(gè)自身對(duì)照)。 【注】:1.若△A 值低于 0.005,可增加樣本加樣體積 V1(如增至 50μL,則試劑一相應(yīng)減少), 則改變后的 V1 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后有沉淀渾濁現(xiàn)象,可在 EP 管中重新按照上表加入相應(yīng)試劑量,加完反 應(yīng) mix 于 30℃避光反應(yīng) 15min 后,室溫 12000rpm 離心 3min,取等體積的上清液至 96 孔板中讀值。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y = 0.7244x-0.0002;x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾濃度(μmol/mL),y 為△A。 2、按樣本鮮重計(jì)算: 單位定義:每小時(shí)每克鮮重樣品中催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個(gè) NR 活力單位。 NR(nmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T=2761×(△A+0.0002)÷W 3、按樣本蛋白濃度計(jì)算: 單位定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個(gè) NR 活力單位。 NR(nmol/h/mg prot)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T=2761×(△A+0.0002)÷Cpr 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: 單位定義:每小時(shí)每百萬細(xì)菌或細(xì)胞催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個(gè) NR 活力單位。 NR(nmol/h/104 cell)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T=5.52×(△A+0.0002) V---加入提取液體積,1mL; V1---加入樣本體積:0.02mL; T---反應(yīng)時(shí)間,30min=0.5h; W---樣本鮮重,g; 500---細(xì)胞數(shù)量,百萬; 標(biāo)準(zhǔn)品亞*酸鈉的分子量---69; Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附:標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程: 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液:用 1mL 的蒸餾水溶解,再用蒸餾水稀釋 200 倍即為 0.5μmol/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。(母 液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存)。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品:0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo) 準(zhǔn)品濃度。 3 按照測定管的加樣步驟操作,根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。