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土壤羥胺還原酶(HR)試劑盒,微板法

土壤羥胺還原酶(HR)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤羥胺還原酶（hydroxylamine reductase,HR）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS4330W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 土壤羥胺還原酶能將土壤中氮代謝過(guò)程中形成的中間產(chǎn)物羥胺還原為氨，土壤中的還原 態(tài)化合物可作為氫的供體，其強(qiáng)弱影響到土壤氮代謝過(guò)程中氮素的氨揮發(fā)損失，間接影響 氮肥的利用效率。 硫酸鐵銨中的 Fe3+可將羥胺氧化為氮?dú)?，自身被還原為 Fe2+，Fe2+在弱酸條件下與鄰 菲羅琳形成橙紅色配合物，在 510nm 處有吸收峰，羥胺還原酶作用于羥胺，使配合物形 成量減少，510nm 處吸光值的減少可反映羥胺還原酶的活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 3mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 5mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 3mL 蒸餾水溶解備用。 試劑七 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 3mL 無(wú)水乙醇溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、天平、常溫離心機(jī)、震蕩儀、氮吹儀。 四、土壤羥胺還原酶（HR）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 土取新鮮土樣風(fēng)干或者 37 度烘箱風(fēng)干，先粗研磨，過(guò) 40 目篩網(wǎng)備用。 【注】：1.壤表層溶解氧濃度較大，取樣應(yīng)取表層 5cm 以下的土壤，否則酶活性較低或者測(cè)定不到。 2.土壤風(fēng)干，減少土壤中水分對(duì)于實(shí)驗(yàn)的干擾；土壤過(guò)篩，保證取樣的均勻細(xì)膩； 2、上機(jī)檢測(cè)： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 510nm。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3 試劑三盡量不要敞口放置，取完立即加蓋擰緊。 4 反應(yīng)體系能用氮吹儀排除溶解氧，若無(wú)此裝置，則加入試劑三后立即密封。 5 在 1mLEP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 空白管 測(cè)定管 對(duì)照管 風(fēng)干土樣（g） 0.02 0.02 試劑一 40 40 蒸餾水 40本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 40 40 40 試劑三 120 120 120 混勻后，用 N2氣流排除管中空氣，立即密封，于 30℃反應(yīng) 1h 試劑四 80 80 80 充分震蕩 10min，8000rpm，室溫（25℃）離心 10min，取上清液待測(cè)。 6 顯色反應(yīng)，在 96 孔板中依次加入： 上清液 20 20 20 試劑五 40 40 40 試劑六 20 20 20 試劑七 20 20 20 蒸餾水 100 100 100 充分混勻，25℃靜置顯色 10min，于 510nm 處讀取各管吸光值 A， △A＝A 空白－（A 測(cè)定－A 對(duì)照）。 【注】若△A 在零附近徘徊，可加大土壤取樣量（如增至 0.05g），或延長(zhǎng) 30℃的反應(yīng)時(shí)間至 4h 或更 長(zhǎng)，或在顯色反應(yīng)階段加大上清液的量（如增加至 50μL，則蒸餾水相應(yīng)減少）。則改變后的 樣本質(zhì)量 W 或反應(yīng)時(shí)間 T 或上清液體積 V2 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y = 1.1234x - 0.0029，x 是標(biāo)準(zhǔn)品羥胺質(zhì)量（μg），y 是△A。 2、酶活定義：每克土壤每小時(shí)轉(zhuǎn)化 1μg 羥胺為一個(gè)酶活力單位。 HR 活性(μg/d /g 土樣)=(△A+0.0029)÷1.1234×(V1÷V2)÷W÷T =12.5×(△A+ 0.0029)÷W V1---加入提取液體積，0.28mL； V2---顯色反應(yīng)階段上清液體積，0.02mL W---樣本質(zhì)量，g； T---1h。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 2ml 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg/mL。也可根 據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段加樣體系操作，20μL 上清液換成標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量為橫坐 標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。