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磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性試劑盒微板法

磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 磷脂酸磷酸酯酶（Phosphatidate phosphatase）活性測(cè)定試劑盒 （貨號(hào)：WS2290W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 磷脂酸磷酸酯酶也稱為磷酸化酶磷酸酯酶（EC 3.1.3.17，PPase）是磷酸酯酶中的一種， 在脂類(lèi)合成的信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用，其活性對(duì)含油量的提高具有重要意義，可作為 育種選擇高含油量品種的生化指標(biāo)。 本試劑盒利用磷脂酸磷酸酯酶（PPase）催化β-甘油磷酸分解產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷分子，通過(guò)定 磷試劑測(cè)定無(wú)機(jī)磷增加速率，即可得出磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 【注】:全程需無(wú)磷環(huán)境；試劑配置用新槍頭和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。4℃×12000rpm 離 心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 700nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ② 依次在 EP 管孔板中加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 200 200 試劑二 50 50 樣本 50 35℃ 孵育 30min 試劑三 100 100 樣本 50 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測(cè) ③ 顯色反應(yīng)，在 96 板中加入： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉末全部落入底部， 加入 11mL 蒸餾水混勻溶解備用。 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 4mL×1 瓶 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 3.6mL 的 B 液， 再加 46.4mL 的蒸餾水，混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 上清液 50 50本試劑盒僅供科研使用 2 【注】若△A 在零附近，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 100μL，則試劑一相應(yīng)減少）， 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 1 小時(shí)），則改變后的 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.6161x - 0.0038，x 是標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白催化產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 PPase 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2] ÷(V1×Cpr)÷T =26×(△A+0.0038)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 定義：每小時(shí)每克組織催化產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 PPase 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷(W×V1÷V)÷T =26×(△A+0.0038)÷W 4、液體中 PPase 活力計(jì)算: 定義：每小時(shí)每毫升液體催化產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 PPase 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷V1÷T=26×(△A+0.0038) V---提取液體積，1mL； V1---樣本體積，0.05mL ； V2---酶促反應(yīng)總體積，0.4mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1/2 小時(shí)； W---樣本鮮重，g； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1. 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（50μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 1mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內(nèi)用）。 2. 把母液用蒸餾水稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本 來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3. 依據(jù)顯色反應(yīng)階段測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 試劑四 200 200 混勻，室溫靜置 3min，700nm 下讀取各管吸光值， △A=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。