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乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒,微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 乙酰*酶 A 羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS4190W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 乙酰*酶A羧化酶（ACC，EC 6.4.1.2）廣泛存在于生物界。在生物體內(nèi)催化乙酰*酶A 羧化生成丙二酰*酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定 程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 ACC催化乙酰*酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰*酶A、無機(jī)磷和ADP，ADP與磷酸烯 醇式丙酮酸在丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的逐一作用下，使NADH氧化為NAD+，通過檢測 NADH在340nm處的下降量來計(jì)算ACC的酶活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 每支用前甩幾下使試劑落入底部，再 加 0.55mL 的蒸餾水溶解備用。用不 完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù) 凍融，三天內(nèi)用完。 試劑三 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、乙酰*酶 A 羧化酶（ACC）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液；超聲波破碎 細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離 心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104)：提取液(mL)為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測，若渾濁離心后取上清測定。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)置溫度 37℃,調(diào)節(jié)波長至 340nm。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 試劑放在 37℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱 測定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 20 試劑三 10 試劑四 150 混勻，37℃下，孵育 10min 試劑五 10 混勻，37℃下，立即于 340nm 處讀取吸光值 A1， 10min 后讀取 A2，△A=A1-A2。 【注】：1.若ΔA 過小，可以延長反應(yīng)時(shí)間（如：22min 或更長）再讀取 A2，或增加樣本加樣量 V1（如 增至 40μL，則試劑四相應(yīng)減小），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2.若 A2 值小于 0.45 或△A 大于 0.6，則需縮短反應(yīng)時(shí)間 T（如減至 12min）再讀取 A2 或減少樣 本量 V1（如減至 5μL，則試劑四相應(yīng)增加），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重 新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 ACC(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 ACC(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W 3、按細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 ACC(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA 4、按液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體樣本每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 ACC(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=643.1×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； T---反應(yīng)時(shí)間，10 min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。