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中性轉(zhuǎn)化酶(NI)/細(xì)胞質(zhì)試劑盒,微板法

中性轉(zhuǎn)化酶(NI)/細(xì)胞質(zhì)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（Neutral invertase, NI）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS6150W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 蔗糖酶即蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，E.C.3.2.1.26）在蔗糖代謝中催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，是高等 植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)最適 PH 值，蔗糖轉(zhuǎn)化酶分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩 種類(lèi)型，許多報(bào)道均將中性轉(zhuǎn)化酶同堿性轉(zhuǎn)化酶看作一種轉(zhuǎn)化酶。NI 的最適 PH 值在 7.0 左右，主要存 在于細(xì)胞質(zhì)中，負(fù)責(zé)分解細(xì)胞質(zhì)中蔗糖為果糖和葡萄糖。 NI 催化蔗糖分解產(chǎn)生還原糖，進(jìn)一步與 3,5－二硝基水楊酸反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合物，經(jīng)光譜掃 描在 540nm 有特征光吸收，在一定范圍內(nèi) 540nm 光吸收值與還原糖生成量成正比。通過(guò)光吸收增加速 率來(lái)計(jì)算 NI 活性 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前加入 7.5mL 試劑一充分溶 解備用；用不完的試劑 4℃保存; 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（NI）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 稱樣本 0.1g（水分充足的樣本可取 0.5g）于研缽中，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿后 轉(zhuǎn)入離心管中。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注意】 若樣本含糖量高，可引起 A 對(duì)照值較大如超過(guò) 1.6，即檢測(cè)背景值過(guò)高會(huì)影響檢測(cè)，可在樣本 制備過(guò)程中增加除糖步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇 冰浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng)預(yù)冷的 80% 乙醇混勻，4℃放置 5min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷 提取液渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 40 40 試劑一 100 200 試劑二 100 混勻，37℃準(zhǔn)確水浴 20min 后，95℃水浴 10min（用封口 膜纏緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保 證濃度不變）。 試劑三 100 100 混勻，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊，以防止水分散失）， 流水冷卻后充分混勻，吸取 200μL 轉(zhuǎn)移至 96 孔板中，本試劑盒僅供科研使用 2 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定 管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】：1.若吸光值大于 1.5，可以用蒸餾水稀釋樣本后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù) D。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 80μL，則試劑一相應(yīng)減少）， 或延長(zhǎng) 37℃水浴時(shí)間（如增至 40min 或更長(zhǎng)），則相應(yīng)的 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0.0056x - 0.0153；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。 NI 活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.0153)÷0.0056]÷(V1×Cpr)÷T =223.2×(ΔA +0.0153 )÷Cpr 3、按鮮重計(jì)算： 單位定義：37℃每克組織每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。 NI 活性(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0153)÷0.0056]÷(W×V1÷V2)÷T =223.2×(ΔA +0.0153 )÷W V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL； T---反應(yīng)時(shí)間，20min； W---樣本鮮重，g； Cp---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái) 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照：40μL 標(biāo)準(zhǔn)品+200μL 試劑一+100μL 試劑三，依次加樣操作，95℃水浴 10min， 冷卻后，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下測(cè)定，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。