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UDPG焦磷酸化酶試劑盒,微板法

UDPG焦磷酸化酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP）試 劑盒說(shuō)明書 （貨號(hào)：WS5350W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： UDPG 焦磷酸化酶（UGP，EC 2.7.7.9）是碳水化合物代謝的重要指標(biāo)之一，廣泛 分布于自然界中，在微生物及動(dòng)植物的許多組織中都有存在。催化葡萄糖活化，將 1- 磷酸葡萄糖與 UTP 分子合成為 UDP-葡萄糖（UDPG）。為各類碳水化合物包括蔗糖、 葡聚糖、纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、糖蛋白等的合成提供葡萄糖基。 UGP 可逆催化反應(yīng)生成 1 磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶 作用下將 NADP 轉(zhuǎn)化為 NADPH，340nm 的吸光值增加速率反映了 UGP 活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體15mL×1瓶 4℃保存 試劑二 粉體×1支 -20℃保存 臨用前加1.1mL試劑一溶解， 仍-20℃保存。 試劑三 粉體mg×1瓶 4℃保存 臨用前加 5.4mL 去離子水溶解。 試劑四 粉體mg×1瓶 4℃保存 臨用前加 5.4mL 去離子水溶解。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、天平、低溫離心機(jī)、研缽、蒸餾水。 四、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.2g），加 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：也可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)胞樣本： 取 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液；超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 1000~5000：1 的比例進(jìn)行 提取 ③ 液體樣品：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，設(shè)定溫度為 30℃。 ② 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 10 試劑一 80 試劑二 10本試劑盒僅供科研使用 2 【注】1. 若ΔA 差值在零附近徘徊，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 20min 后讀取 A2，則相應(yīng)的 反應(yīng)時(shí)間 T 則代入計(jì)算公式重新計(jì)算； 或者加大樣本上樣量（如：由 10μL 增加到 20μL，則試劑一相應(yīng)減少，保持 總體積 200μL 不變），改變后的加樣體積即 V1 代入計(jì)算公式重新計(jì)算； 或者由 0.1g 樣本取樣量增加到 0.2g，加 1mL 的提取液研磨提取。 2. 若上升趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 10S 讀取一次吸光值，選取一段線性 上升的時(shí)間段來(lái)參與計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的 A1 和 A2 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。 UGP（nmol/min/mg prot）＝[△A÷（ε×d）×V2×109]÷（V1×Cpr）÷T =1607.8×△A÷Cpr （2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算 酶活定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。 UGP（nmol/min /g 鮮重）＝[△A÷（ε×d）×V2×109]÷（W ×V1÷V）÷T =1607.8×△A÷W （3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 酶活定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。 UGP（nmol/min /104 cell）= [△A÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V) ÷T =3.2×△A （4）按照液體體積計(jì)算 酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。 UGP（nmol/min /mL）=[△A÷（ε×d）×V2×109]÷V1÷T=1607.8×△A ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； T---反應(yīng)時(shí)間，4min； 500---細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)； W---樣本質(zhì)量，g ； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 試劑三 50 輕輕混勻，30℃孵育 10min。 試劑四 50 輕輕混勻，反應(yīng)開始，1min 時(shí)在 340nm 處讀取吸光值 A1， 5min 時(shí)讀取 A2，△A=A2-A1。