解析抗體常見問題

1. Q：多抗和單抗的區(qū)別？

A: 多抗是多個B細胞克隆產(chǎn)生的針對多種抗原表位的多種抗體混合物，單抗是一個B細胞克隆產(chǎn)生的針對一種抗原表位的的單一抗體。

2. Q：多抗較單抗的優(yōu)勢是什么？

A: a.*制備成本低廉，制備所需技術(shù)要求不高，制備周期短。

b. 能識別一個抗原上的多個表位，可在IP等實驗中獲得更好的結(jié)果。

c. 多抗因為靶蛋白可在多個表位上結(jié)合不止一個抗體分子，有助于放大低表達水平的靶蛋白信號。

d. 能識別出與免疫原蛋白質(zhì)具有高同源性的蛋白質(zhì)，或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白，例如當未測試物種中的抗原性質(zhì)未知時，有時會使用多克隆抗體。e. 可識別多個結(jié)構(gòu)域，即使原始抗原的一些空間結(jié)構(gòu)或者序列發(fā)生小變化或者部分抗原決定簇變化，仍可以識別抗原，因此有更大的適應(yīng)性。

3. Q: 多抗較單抗的劣勢是什么？

A: a. 易于產(chǎn)生批次間差異，重新制備成本高。b. 產(chǎn)生大量非特異性抗體，有時可能在某些應(yīng)用中產(chǎn)生背景信號。

4. Q：單多抗如何選擇？

A: 對抗體的特異性要求高，用量較大或需要使用一致的抗體，制備的抗體應(yīng)用要求多。例如，WB/IP/IF/ICC等，一般選擇單抗。對抗體的特異性要求不高，需要做沉淀和凝集反應(yīng)的檢測性實驗或者只需做ELISA檢測，一般選擇多抗。

5. Q: WB，IHC，IP/ChIP類型抗體有什么區(qū)別？

A: WB：目前較常做的類型，WB識別的蛋白是經(jīng)過加熱變性之后都變成線性結(jié)構(gòu)的蛋白。

IHC：免疫組化中需要進行固定一步，固定是為了盡量讓細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。

IP/ChIP：這類實驗是用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP和ChIP的抗體較好使用純化的天然蛋白制作的抗體。

6. Q：目的蛋白分子量為何與實際不符？

A: 當條帶所示的實際大小與理論有偏差時，可能有以下原因?qū)е拢旱鞍装l(fā)生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時條帶會上移，蛋白發(fā)生剪切（如前體）時條帶會下移，蛋白存在不同的可變剪切體或亞型，強相互作用大分子存在時變性不*。

7. Q: 多抗做WB檢測為何有雜帶？

A: a. 從純化方式來看：采用ProteinA/G純化的多抗摻雜有動物本身產(chǎn)生的對其自身抗原產(chǎn)生的抗體，這些抗體在檢測中會識別樣本中的蛋白而出現(xiàn)雜帶，可以采用抗原親和純化避免雜帶的產(chǎn)生。

b. 從蛋白修飾來看：天然蛋白存在復(fù)雜的翻譯后修飾。這點可以通過信息學(xué)分析進行解釋。

c．從蛋白翻譯后加工來看：翻譯后蛋白前體經(jīng)切割可能會使部分蛋白分子量偏小，而天然組織中同時存在蛋白前體和切割加工后的蛋白，二者序列有相同部分，可能會產(chǎn)生雜帶。這點需要通過查閱與目的蛋白相關(guān)文獻進行了解。

d．從同源家族蛋白來看：當目的蛋白有同源家族蛋白時，蛋白異構(gòu)體的存在可能會使分子量偏離預(yù)測分子量，因為天然樣本中由同一個mRNA不同的剪接方式進行翻譯形成的蛋白產(chǎn)物也會有相同的抗原表位，同時被抗體識別時會產(chǎn)生雜帶。

e. 從蛋白聚集形式來看：蛋白多聚體的形成，雖然還原條件可以抑制多聚體的形成，但是強烈的蛋白間相互作用在還原條件下也有可能不解聚導(dǎo)致條帶偏大。

8. Q：抗體做WB為何不識別內(nèi)源樣本？

A: a. 蛋白在天然樣本中的豐度太低，此時需要進行富集或者過表達再進行檢測。b. 如果豐度不低，單抗/多抗不識別內(nèi)源可能是該抗體識別的表位在天然蛋白中有修飾位點，此時需要對蛋白進行修飾位點的分析。

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         南京卡米洛生物工程有限公司