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公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：

Ni-NTA Resin 是用于純化 6×His 標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由 4%交聯(lián)的 Sepharose 耦連了一種四齒螯合劑 NTA 而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的 6xHis 標(biāo)簽重組蛋白。NTA，含有四個螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合 Ni2+。6×His 可與 Ni2+螯合，從而使 His 標(biāo)簽蛋白結(jié)合在 Ni-NTA 純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低 PH 緩沖液被溫和的洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。
主要特征
該純化介質(zhì)與 His 標(biāo)簽蛋白具有的親和力，可達(dá)5-20 mg/ml。
可在非變性和變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的 His標(biāo)簽蛋白。
純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達(dá) 95％。
Ni-NTA 可再生 4-6 次，重復(fù)使用。
組成：50％的懸浮液（20％乙醇），已螯合 Ni2+。
應(yīng)用
His 標(biāo)簽蛋白的純化。
蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究。
蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之間相互作用的研究。
配體-受體之間相互作用的研究。
儲存：4℃保存，可保存 2 年。
操作方法
A. 非變性條件下抽提 His 標(biāo)簽蛋白
1. 樣品準(zhǔn)備
1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。對于實(shí)驗(yàn)室用的 pET 載體表達(dá)系列，在細(xì)胞 OD600=0.5-0.8 時，用 1 mM IPTG 誘導(dǎo) 1-3 小時，可以獲得理想的表達(dá)效率。收集細(xì)胞，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟 2 操作。
2) 加入 1/20 細(xì)胞生長體積的 NTA-0 Buffer (20 mMTris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1 mM PMSF。
注意：PMSF 見水分解，需要在使用前加入。
3) 將細(xì)胞懸浮起來，超聲或勻漿破碎細(xì)胞。該步驟冰上操作。
4) 加入 10% Triton X-100, 使終濃度為 0.05%，充分混勻，冰上放置 15 分鐘。
5) 13,000 轉(zhuǎn)/分(20,000xg 以上)，4°C 離心 15min。取上清，置于冰上備用或-20°C 保存。
2. 層析
1) 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 將上清樣品加至 NTA 層析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。
3) 層析用 5 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗滌填料，流速控制在 30 ml/h 左右。
4) 再分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脫填料，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。
5) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。
6) 目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。
3. 溶液配方
NTA-0 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
NTA-20 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
20 mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,

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