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傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法

2021-9-7  閱讀(230)



 1 、原理

  體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代,以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞,并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后,由于密度過(guò)大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭,將培養(yǎng)的細(xì)胞分散,從容器中取出,以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng),即為傳代培養(yǎng)。

  細(xì)胞“一代"指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間,與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中,細(xì)胞培增3~6次。細(xì)胞傳代后,一般經(jīng)過(guò)三個(gè)階段:游離期、指數(shù)增生期和停止期。

  常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度,即細(xì)胞群的分裂相數(shù)/100個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2%~0.5%,腫瘤細(xì)胞可達(dá)3~5%。細(xì)胞接種2~3天分裂增殖旺盛,是活力最好時(shí)期,稱指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生),適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)。

 2 、操作

 ?、伲畬㈤L(zhǎng)成單層的原代培養(yǎng)細(xì)胞或HeLa細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出,在超凈工作臺(tái)中倒掉瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液,加入少許消化液。(以液面蓋住細(xì)胞為宜),靜置5~10分鐘。

 ?、?在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞,如果細(xì)胞變園,相互之間不再連接成片,這時(shí)應(yīng)立即

  在超凈臺(tái)中將消化液倒掉,加入3~5ml新鮮培養(yǎng)液,吹打,制成細(xì)胞懸液。

 ?、郏畬⒓?xì)胞懸液吸出2ml左右,加到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中并向每個(gè)瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液,蓋好瓶塞,送回二氧化碳培養(yǎng)箱中,繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

 3 、結(jié)果

  一般情況,傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,2~4天就可在瓶?jī)?nèi)形成單層,需要再次進(jìn)行傳代。

   器材及液體的準(zhǔn)備和無(wú)菌操作的注意事項(xiàng) :

  1)、 器材和液體的準(zhǔn)備

  細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材,如:培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后,裝在鋁盒和鐵筒中,120℃,2小時(shí)干烤滅菌后備用;手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅,20分鐘蒸氣滅菌;MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用。

    2)、 無(wú)菌操作中的注意事項(xiàng)

  在無(wú)菌操作中,一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔。為此,在操作前要認(rèn)真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20~30分鐘起動(dòng)超凈臺(tái)吹風(fēng)。操作時(shí),嚴(yán)禁說(shuō)話,嚴(yán)禁用手直接拿無(wú)菌的物品,如瓶塞等,而要用器械,如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺(tái)內(nèi)才能打開(kāi)瓶塞,打開(kāi)之前用乙醇將瓶口消毒,打開(kāi)后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下,打開(kāi)瓶口后的操作全部都要在超凈臺(tái)內(nèi)完成。操作完畢后,加上瓶塞,才能拿到超凈臺(tái)外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端,將頂端在火上燒一下,戴上膠皮乳頭,然后再去吸取液體??傊?,在整個(gè)無(wú)菌操作過(guò)程中都應(yīng)該在酒精燈的周?chē)M(jìn)行。



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