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ELISA試劑的原料和制備方法
2021-8-5 閱讀(1314)
ELISA 的技術(shù)要點(diǎn)包括三個(gè)方面：試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。ELISA 的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。
（一）固相載體
可作 ELISA 中載體的物質(zhì)很多，常見(jiàn)的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在 ELISA 測(cè)定過(guò)程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。
LISA 載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，最后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑 0.6 cm 的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過(guò)程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。，常見(jiàn)的載體為微量反應(yīng)板，專(zhuān)用于 ELISA 測(cè)定的產(chǎn)品也稱(chēng)為 ELISA 板，國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是 8×12 的 96 孔式。
為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成 8 聯(lián)或 12 聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn) ELISA 板相同。ELISA 板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的 ELISA 檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
良好的 ELISA 板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯 ELISA 板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人 IgG（一般為 10ng/ml）包被 ELISA 板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人 IgG 抗人 IgG 抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在 0.8 左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于 10％。
與聚苯乙烯類(lèi)似的塑料為聚氯乙烯。作為 ELISA 固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。
為比較不同固相在某一 ELISA 測(cè)定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其它免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和一個(gè)典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的 ELISA 操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較測(cè)定結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果判別最大，這種載體就是這一 ELISA 測(cè)定的最合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測(cè)定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類(lèi)測(cè)定形式將在本章第五節(jié)「膜載體的酶免疫測(cè)定」中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時(shí)固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
（二）抗原和抗體
在 ELISA 實(shí)施過(guò)程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)。
ELISA 所用抗原有三個(gè)來(lái)源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱(chēng)提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍，特別是對(duì)那些天然抗原不易得到的試驗(yàn)，更顯出其獨(dú)到之處。
用于 ELISA 的抗體有多克隆的和單克隆的。抗血清成分復(fù)雜，應(yīng)從中提取 IgG 才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時(shí)可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的 IgG 可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性 IgG，如用酶消化 IgG 后提取的 Fab 片段，則效果更好。
（三）免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱(chēng)為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱(chēng)為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（ pH9.6 的碳酸緩沖液）中，加于 ELISA 板孔中在 4℃ 過(guò)夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面，最后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用 1％～5％ 牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過(guò)程稱(chēng)為封閉（blocking）。包被好的 ELISA 板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性。
（四）酶和底物
ELISA 中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專(zhuān)一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收高。ELISA 中的酶為辣根過(guò)氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。
HRP 在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約 18％；分子量為 44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無(wú)色糖蛋白，在 275nm 波長(zhǎng)處有吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在 403nm 波長(zhǎng)處有吸收峰。HRP 催化反應(yīng)：
DH2 + H2O2—— D +2 H2O
上式中 DH2 為供氫體，H2O2O 為受氫體。HRP 對(duì)受氫體的專(zhuān)一性很高，除 H2O2 外，僅作用于小分子醇的過(guò)氧化物和尿素的過(guò)氧化物。后者為固體，作為試劑較 H2O2 方便。許多化合物可作為 HRP 的供氧體，在 ELISA 中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）和 ABTS[2，2'-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。
OPD 為在 ELISA 中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB 無(wú)此缺點(diǎn)。TMB 經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見(jiàn)增多。ABTS，雖然靈敏度不如 OPD 和 TMB，但空白值很低。
HRP 的純度用 RZ（ReinheitZahl，意為純度數(shù)）表示，是 403nm 的吸光度與 280nm 的吸光度之比，高純度的 HRP 的 RZ≥3.0。應(yīng)注意的是酶變性后，RZ 可不變而活力降低，故重用酶制劑時(shí)更重要的指標(biāo)為活力。酶活力以單位表示：1 min 將 1μmol 的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為 1 個(gè)單位。
在 ELISA 中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的 AP 分子量為 80kD，酶作用的最適 pH 為 8.0；用小牛腸粘膜提取的 AP 分子量為 100kD，最適 pH 為 9.6。一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在 405nm 有吸收峰。用 NaOH 終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。
在 ELISA 中應(yīng)用 AP 系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用 HRP 系統(tǒng)，空白值也較低。但由于 AP 較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較 HRP 低，價(jià)格較 HRP 高，制備酶結(jié)合物時(shí)得率較 HRP 低等原因，國(guó)內(nèi)在 ELISA 中一般均采用 HRP。
除 HRP 和 AP 以外，在商品 ELISA 試劑中應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。
β-半乳糖苷酸的底物常用 4-甲基傘基-β-D 半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì) 4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone），可用熒光計(jì)檢測(cè)。
熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP 也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點(diǎn)是需要熒光計(jì)測(cè)定，而且如用固相載體直接作為測(cè)定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點(diǎn)是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生 pH 改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒(méi)有內(nèi)源酶（酶的化學(xué)發(fā)光底物見(jiàn)第十八章）。
（五）結(jié)合物
酶標(biāo)記的抗原或抗體稱(chēng)為結(jié)合物（conjugate）?？乖捎诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。
1．戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過(guò)它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接 AP），也可用二步法（如連接 HRP）。舉例如下：
2～5 mg 純抗體與 5 mgAP 混合于 0.1mol/LpH6.8 的磷酸緩沖液 1 ml 中，4℃ 下對(duì)同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下，緩慢加入 1％ 戊二醛 0.05 ml，在室溫下放置 2 小時(shí)。在 4℃ 下對(duì) 0.05mol/LpH8.0Tris 緩沖液透析平衡，即得酶標(biāo)抗體。
辣根過(guò)氧化物酶可溶解于 50％ 飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用 50％ 飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體，棄去上清中游離酶。
戊二醛一步法操作簡(jiǎn)便、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。
制備 HRP 抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將 HRP 與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在 pH9.5 緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法 10 倍左右。
2．過(guò)碘酸鹽氧化法本法只用于 HRP 的交聯(lián)。該酶含 18％ 碳水化合物，過(guò)碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用（NaBH4）中和多余的過(guò)碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成按摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過(guò)氧化物酶交聯(lián)*的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。
按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響 ELISA 中最后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡(jiǎn)便，但效果不如用 SephadexG-200 凝膠過(guò)濾的好。
