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細(xì)胞培養(yǎng)

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轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備步驟

2021-1-14  閱讀(310)

轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備:

1. 器材

旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5 ml 微量離心管,雙面微量離心管架,干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋),制冰機(jī),恒溫?fù)u床,培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp),超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養(yǎng)箱。

2. 試劑

培養(yǎng)基(不加抗菌素),LB培養(yǎng)基(加抗菌素),無菌ddH2O,IPTG,X-gal。

3. 材料處理

無菌ddH2O,1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。

轉(zhuǎn)化細(xì)胞操作步驟:

1. 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

2. 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100 μl)感受態(tài)菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10 min。

3. 加入5 μl 連接好的質(zhì)粒混合液(DNA含量不超過100 ng),輕輕震蕩后放置冰上20 min。

4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進(jìn)行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5 min。

5. 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

6. 在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100-300 μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

7. 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal,8 μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

8. 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。

9. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

10. 觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。



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