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?PCR反應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化
2024-8-5 閱讀(189)
PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液(10×PCR Buffer)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1，Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分組成。各個(gè)組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。
1. 反應(yīng)緩沖液：一般隨Taq DNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3室溫)，1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200μM時(shí)，Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般以1.5-2mM(終濃度)較好。
2. dNTP ：高濃度dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。
3. Taq DNA聚合酶酶：在100μl反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延伸1000-4000個(gè)核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對PCR反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)(如20μl或50μl)，一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降低。
4. 引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：
?、?引物的長度以15-30bp為宜，一般(G+C)的含量在45-55%，Tm值高于55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。
⑵ 引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于5個(gè)，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不能超過3個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。
?、?人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進(jìn)行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體(primer-dimer)，二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μl較好。
?、?引物一般用TE配制成較高濃度的母液(約100μM)，保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5. 模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品(甚至是來自單一細(xì)胞的DNA)作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用μg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。
6. PCR循環(huán)加快，即相對減少變性、復(fù)性、延伸的時(shí)間，可增加產(chǎn)物的特異性
