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上海邦景實業(yè)有限公司
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模板核酸蛋白酶K消化裂解法的提取制備方法
2024-1-15 閱讀(65)
模板核酸蛋蛋白酶K消化裂解法適用于所有標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組 織細胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿，糞便等。
1、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加入消化液中。
2、提取方法:
有些標本、在用蛋白酶K消化前，還需預處理一下，如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等。
臨床標本或經(jīng)預處理的標本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時， 或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的氯仿:異戊醇(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液，加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴增，或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標本，經(jīng)離心處理 后，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴增。 如雜質(zhì)較多，還可經(jīng)酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除掉，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復性與穩(wěn)定性。但操作繁復，技術(shù)要求高。
