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ELISA試劑盒雙抗體夾心法操作說明
2022-6-21 閱讀(437)
ELISA試劑盒雙抗體夾心法是最有用的免疫測定形式之一，它設(shè)計用于檢測可溶性抗原。根據(jù)使用的抗體數(shù)量，該ELISA有兩種形式。兩者的原理是相同的，一種是直接將抗原固定在固相上，另一種是將捕獲抗體固定在固相上以捕獲抗原。
方法原理:
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。ELISA試劑盒雙抗體夾心法操作具體過程如下：
1、包被:
用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
2、加樣:
加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3、加酶標抗體:
于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時，洗滌。
4、加底物液顯色:
于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10~30分鐘。
5、終止反應(yīng):
于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6、結(jié)果判定:
可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以"+"、"-"號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
操作注意要點：
1.加樣：
要用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，加樣時應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，不可出現(xiàn)氣泡。
2.孵育：
孵育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱。
3.洗滌：
洗滌是決定反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，不能忽略此步驟。
4.顯色及終止反應(yīng)：
顯色要按照規(guī)定的溫度和時間操作，用酸終止。
5結(jié)果判斷：
讀結(jié)果時，要保證試驗板是平整透明的，否則會影響比色結(jié)果。
