線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 25 管/24 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義
線粒體復(fù)合體Ⅲ（EC 1.10.2.2）又稱 CoQ-細(xì)胞色素 C 還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)把還原型 CoQ 的氫傳遞給細(xì)胞色素 C，生成還原型細(xì)胞色素 C。
測(cè)定原理
與氧化型細(xì)胞色素 C 不同，還原型細(xì)胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收，因此 550nm 光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。
需自備的儀器和用品
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑六：液體 2.5mL×1 瓶，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
4、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ（此步可選
做）。
5、 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、100μL 試劑六和 800μL 工作液，立即混勻，記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。
復(fù)合體Ⅲ活力單位的計(jì)算：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個(gè)酶活力單位。
? 此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個(gè)酶活力單位。復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ （ε×d ）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)
÷T=124×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.248×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.4×10-4 L；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。
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